Summary
En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.
Abstract
Peter Karlson y Martin Lüscher utiliza el término feromona, por primera vez en 1959 para describir una de las sustancias químicas utilizadas dentro de una especie de comunicación. Las feromonas son volátiles o no-de corta duración moléculas secretadas 2 y / o contenidos en los fluidos biológicos 3,4, como la orina, un líquido conocido por ser la principal fuente de feromonas 3. La comunicación feromonal está implicado en una variedad de modalidades de animales clave, tales como las interacciones familiares 5,6, las organizaciones jerárquicas 3 y 7,8 interacciones sexuales y, en consecuencia, directamente relacionada con la supervivencia de una especie dada 9,10,11. En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (VNO) 10,12, una estructura de pares situados en la base de la cavidad nasal, y encerrado en una cápsula cartilaginosa. Cada OVN tiene una forma tubular con una luz 13,14 permitiendo el contacto con el exteriormundo de la química. El neuroepitelio sensorial se compone principalmente de vomeronasal neuronas sensoriales bipolares (VSNs) 15. Cada VSN se extiende una dendrita única a la luz que termina en una perilla dendríticas que soportan hasta 100 microvellosidades implicados en la detección de productos químicos 16. Subpoblaciones de numerosos VSNs están presentes. Se diferencian por el quimiorreceptores expresan y por lo tanto, posiblemente, por el ligando (s) que reconocen 17,18. Dos familias principales de los receptores vomeronasal, V1Rs y V2Rs 19,20,21,22, están compuestos respectivamente por 240 y 23 120 24 miembros y se expresan en diferentes capas de la neuroepithelium. Los receptores olfativos (OR) 25 y los receptores de formil péptidos (FPRs) 26,27 se expresan también en VSNs.
Si estas subpoblaciones neuronales utilizan la misma vía de señalización corriente abajo de las feromonas de detección es desconocida. A pesar de una importante función desempeñada por un canal de calcio-permeable (TRPC2) presentes en las microvellosidades de las neuronas maduras TRPC2 28 canales de transducción independientes han sugerido 6,29. Debido al elevado número de subpoblaciones neuronales y la peculiar morfología de los órganos, las investigaciones farmacológicas y fisiológicas de los elementos de señalización presente en el VNO son complejas.
A continuación, presentamos una preparación de tejido rebanada aguda del VNO ratón para realizar las investigaciones de calcio de imágenes. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas, en el medio natural de un tejido vivo, de las subpoblaciones de carácter general o individual de VSNs previamente cargadas con Fura-2 am, un colorante de calcio. Este método es también conveniente para el estudio de los receptores de GFP-etiquetados de feromonas y se adapta para el uso de otras sondas fluorescentes de calcio. A modo de ejemplo, se utiliza aquí un VG ratón la línea 30, en la que está vinculada la traducción de los receptores de feromonas V1rb2 a la expresión de GFP de una estrategia de polycistronic.
Protocol
1. La disección de la VNO ratón
- Use los ratones adultos. Como la detección de feromonas está implicado en multimodalidades, cuidadosa distinción entre las cepas, los genotipos, sexos y edades es importante e influirá en los resultados. Aquí, elegimos ratones adultos VG 30 anteriormente utilizados para la identificación de un par de feromona-receptor (2-heptanona V1rb2) 31 (Fig. 1A).
- Antes de comenzar la disección, preparar dulce frío artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF, NaCl 118 mM, NaHCO3 25 mM, D-glucosa 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,4), saturado de oxycarbon (95% O 2, 5% CO 2). Para ello, mezclar todos los componentes excepto ACSF CaCl2. Saturar la solución directamente con burbujas oxycarbon. Al final, añadir el CaCl2 y ajustar con ddH 2 0 hasta el volumen deseado. Mantenga la solución ACSF en hielo hasta use.
- La eutanasia del ratón debe ser preferentemente realizada por dislocación cervical o por inhalación de CO 2 antes del experimento.
- Cortar la cabeza del ratón. Colócalo debajo de un microscopio de disección en frío ACSF continuamente oxycarbonated.
- Cortar la mandíbula inferior y la posición de la cabeza con el fin de visualizar el paladar (Fig. 1B).
- Hacer una incisión horizontal en la parte superior del paladar (Fig. 1B) con unas tijeras micro y quitar la membrana paladar con micro pinza de disección. Hidratar y limpiar la cavidad expuesta con ACSF (Fig. 1C).
- Cortar la parte superior y la parte inferior del tabique nasal (Fig. 1C). Delicadamente extraer el tabique nasal que contiene el VNO y colocarlo directamente en ACSF en el hielo (Fig. 1D).
- Separados verticalmente las dos partes del VNO utilizando micro pinza de disección y delicadamente quite la cápsula cartilaginosa del VNO (Fig. 1E). Asegúrese de que todas las piezas cartilaginosas se retiran.
2. Tejido VNO rebanada preparación
El tejido VNO rebanada preparación se describe en esta sección 2) se debe principalmente a las investigaciones de imágenes de calcio. Rodajas de VNO también puede ser utilizado para immunohistostainings en rodajas flotando para comprobar la integridad estructural de los tejidos (ver sección 3) del Protocolo).
- Prepare bajo punto de fusión de agar (3% en PBS estándar) y su lugar de trabajo. Usted tendrá que ACSF, un microtomo y soportes, micro pinza de disección, la incorporación de los moldes (22 x 22 x 20 mm), toallitas de precisión, cepillos, placas de cultivo tisular, cyanacrylat cola, hielo y un termómetro.
- Rellene el molde con la incorporación de bajo punto de fusión de agar al 3%. Asegúrese de que la temperatura no sea superior a 41 ° C antes de colocar verticalmente el poco borrado VNO (Fig. 2A) para poder obtener cortes coronales.
- Coloque el molde de la incrustación en el hielodurante 1 minuto hasta que la solidificación y luego separado del bloque de agar. Cortar el bloque de agar en una forma piramidal y el lugar con pegamento con el apoyo del microtomo (Fig. 2B).
- Corte coronal rebanadas VNO con el micrótomo, con una velocidad de 0,5 mm / s, con una amplitud de 0,7 mm y un espesor de 100 micras en frío ACSF y recoger los cortes de tejido con un cepillo antes de colocarlos en una placa de cultivo de tejidos llenos de frío ACSF.
- Si su rebanadas contienen fluorescencia endógena como GFP (en genes específicos neuronas), puede seleccionar en un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Fig. 2C).
3. Inmunohistoquímica en cortes VNO flotante
El objetivo de este procedimiento es verificar la integridad de las secciones de tejidos VNO obtenido en el apartado 2). -Tubulina acetilada es un marcador de microtúbulos / citoesqueleto se expresa en las dendritas de las neuronas y microvellosidades VNO sensorial. Para los experimentos de imagen de calcio, vaya direcciónTLY a la sección 4) del Protocolo. El método de flotación immunohistostaining rebanadas VNO puede ser adaptado a la evaluación de la expresión de la proteína de interés. Para ello, le recomendamos que fijar el VNO durante 1 hora a 4 ° C en una solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,6) después de que el punto 1.7) del Protocolo y el uso de este punto en PBS pH 7,6 en lugar de ACSF solución.
- En la placa de cultivo de tejidos, arreglar sus tajadas de interés en una solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C.
- Bloquear su cortes de tejido durante la noche a 4 ° C en una solución de PBS que contiene NGS (suero de cabra normal) 10% y Triton X-100 al 0,5%.
- Incubar las rebanadas con el anticuerpo primario (anti-tubulina acetilada, ratón, 1:2000) de 16h a temperatura ambiente (TA) en una solución de PBS que contiene NGS 5% y Triton X-100 en el 0,25%.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos con una solución de PBS que contenía 2% de NGS.
- Incubar en la oscuridad con el secoanticuerpos Ndary (Cy5-conjugado de cabra anti-ratón, 1:200) en una solución de PBS que contenía 2% de NGS 1h a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS que contenía 2% de NGS, NGS PBS 1% y PBS.
- Monte su rebanadas en un medio fluorescente de montaje (que contienen o no DAPI), colocándolos en el centro de las zonas delimitadas hidrofóbica (usar un lápiz hidrofóbico) y cubrir los cortes con cubreobjetos.
- Hacer observaciones y adquisiciones con microscopía confocal y un software que permite reconstrucciones en 3D (Fig. 2D-F).
4. El calcio de imágenes en rodajas VNO
- Los siguientes procedimientos se llevarán a cabo en la oscuridad. Incubar VNO rodajas de 1 hora a 37 ° C en una solución de carga compuesto por frío ACSF con Fura-2AM (7 M; solución madre de 1 mM en DMSO) y 0,1% Pluronic (w / v; solución madre al 20% en ddH 2 O).
- Mantenga los segmentos cargados en el hielo con oxycarbonation hasta su uso. Rodajas de carga se puede mantener durante3-4h.
- Colocar las rebanadas de carga con un pincel en una cámara de perfusión que contiene ACSF y mantener las rebanadas con un ancla de lámina de tejido (Fig. 3).
- Coloque la cámara de perfusión sobre la platina de un microscopio de imagen de calcio (Fig. 3B) y continua con perfusión oxycarbonated ACSF a temperatura ambiente. La temperatura puede ser adaptada con el uso de un controlador de temperatura bipolar.
- Observaciones de la carga rebanadas VNO (Fig. 3C-E) se llevan a cabo con un microscopio de fluorescencia invertido, con un objetivo de 25x o 63x y una cámara de frío SNAP-HQ. La iluminación se realiza de forma secuencial (340/380 nm) con un instrumento policromador y grabarla a una frecuencia de 5 Hz. Emisión de filtrado se realiza a 510 nm. Intracelular de calcio cambios de relación (Df = 340 nm/380 nm) son controlados con un software apropiado.
- Chemostimulation deben ser seleccionados de acuerdo a sus fines experimentales. En este caso, la perfusión de ACSF que contiene una feromona mix (ISOBUTILAMINA, 2-heptanona, 4-heptanona, 2 heptanol, pentylacetate, dimetilpirazina, α / β-farneseno, 10 -6 M), 2-heptanona (10 -6 M) o recién extraído hombres y mujeres (1: 1) la orina del ratón (1:100) se llevan a cabo 32. La perfusión de ATP (125 M) se utiliza como una prueba de viabilidad en el final de los experimentos (Fig. 3F) y deben indicar una proporción de aproximadamente el 80% neuronas viables. En estas condiciones, las rebanadas se pueden utilizar hasta 2 horas.
- Subpoblaciones GFP-etiquetado de las neuronas sensoriales son visualizados por la iluminación específica (en este caso las neuronas que expresan V1rb2) y se puede analizar con precisión (Fig. 3G-I).
5. Los resultados representativos:
Para establecer un ensayo funcional para investigar la transducción de múltiples vías que tienen lugar en el OVN ratón, o para identificar nuevos receptores de feromonas-pares, nos aprovechamos de la línea de VG ratón (Fig. 1A (Fig. 1E), nos preparamos agudas rodajas de VNO (Fig. 2C). Fijamos una fracción de ellos, con el fin de comprobar y validar la integridad tisular de la preparación mediante la realización de immunohistostainings contra la proteína tubulina acetilada-(Fig. 2D-F). La otra fracción de los cortes es utilizado para los experimentos de imagen de calcio. Para ello, los segmentos están cargados con Fura-2AM (Fig. 3C-E) y el nivel de calcio intracelular de cada neurona se controla como una relación de Df (Fig. 3F). La viabilidad de las neuronas es evaluada por la perfusión de la ATP (125 M), tras lo cual aumento rápido y transitorio de la relación de Df se espera (Fig. 3F). La orina es una importante fuente de feromonas, la perfusión de agua dulcemente recogido la orina del ratón (1:100) se utilizó como control endógeno. Se dispara transitorios de calcio en aproximadamente el 50% de las neuronas registradas (casilla 1 y 2, fig. 3F). En virtud de las buenas prácticas agrarias iluminación, V1Rb2 neuronas positivas son observables, y la perfusión de su ligando conocido feromonal, 2-heptanona, inicia la activación celular (la celda 1, fig. 3I). Curiosamente, las activaciones neuronales se observa también en una fracción de las neuronas que no expresan el receptor de V1Rb2 (neuronas GFP negativas) (la celda 2, fig. 3I), lo que demuestra la complejidad de la codificación de feromonas en el OVN.
Figura 1. Disección del órgano vomeronasal del ratón. (A) Un ratón en la línea de VG. (B) Después de la eutanasia con el ratón, la cabeza llena se coloca bajo un microscopio binocular y la mandíbula inferior se retira con el fin de visualizar el paladar. Una pequeña incisión horizontal se hace(Línea discontinua negro). (C) Después de la extirpación del paladar, el tabique nasal alineadas con el VNO se corta en la parte superior y la parte inferior (líneas discontinuas blancas) para facilitar la extracción VNO. (D) El VNO se coloca en una solución de ACSF y separados (insertar: mayor poder ver de las dos partes). (E) La cápsula cartilaginosa del VNO es delicadamente retirado, y el OVN, sin su cápsula cartilaginosa se utiliza para el resto de los experimentos. Las barras de escala son los siguientes: BE, 1 mm.
Figura 2. Vomeronasal del ratón rebanada preparación aguda y la integridad tisular. (A) El VNO ratón verticalmente integrados en una solución de agar al 3%. La temperatura del agar debe ser inferior a 41 ° C. (B) El bloque de agar se corta en forma piramidal y 100 micras secciones VNO (línea discontinua negro) se generan en ACSF. (C) rebanadas VNO puede ser seleccionado en un microscopio estereoscópico fluorescente para visualizar un determinadopoblación de etiquetado neuronas sensoriales. (DF) la integridad tisular puede ser evaluada por immunohistostainings contra la proteína tubulina acetilada-, a fin de poder más alto de la V1rb2 de genes diana, las neuronas muestran la perfecta conservación de la preparación. Las neuronas con sus dendritas largo alcance la superficie de la luz (E), así como la expresión de la proteína estructural en los mandos dendríticas y microvellosidades se puede observar (F). Las barras de escala son: B, 5 mm; C, 60 micras; D, 40 m; EF, de 20 micras.
Figura 3. Calcio de imágenes y detección de las feromonas en vomeronasal cortes de tejido aguda. (A) Después de un Fura-2AM fase de carga, las rebanadas de VNO se colocan en una cámara de perfusión y se mantienen con un ancla adaptado (ver alta potencia). (B) Los experimentos se realizan en los cortes oscuros y VNO están continuamente perfundidos con ACSF a temperatura ambiente con un sistema de vacío. La temperatura se puede chosen el uso de un sistema regulador de temperatura compuesto por un elemento bipolar Pelletier y una sonda térmica. Este experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente. (CE) rodajas de VNO se pueden observar en contraste de fase Hoffman (C, Hv) o Fura 380 nm antes de la iluminación (D) y durante la activación neuronal (E, aquí con el ATP). (F) la viabilidad neuronal se evalúa con la perfusión de la ATP (125 M). Aquí, chemostimulation se hace con la orina (orina, 1:100) o con una mezcla de las feromonas del ratón (pH de la mezcla., 10 -6 M) con un caudal constante de 165 ml / h. Los niveles intracelulares de calcio (Df) se pueden grabar de forma individual para cada celda (celda 1 a 3). (G) Una neurona V1Rb2 se visualiza en las buenas prácticas agrarias de iluminación (1). (H) La carga de esta neurona (1), así como una neurona no V1rb2 expresar (2) se muestra. (I) La neurona V1rb2 es capaz de responder a la 2-heptanona con un aumento del calcio intracelular. Este particular no V1rb2 neuronas que expresan también responde a la 2-heptanona (casilla 2). Las barras de escala son: CE, 20 m; GH,15 micras, Df = 340 nm / 380 nm. (F e I) Duración de la aplicación de estímulo se indica mediante las barras en cada trazo. La escala de color arbitraria representa la intensidad de la fluorescencia.
Discussion
El método de imágenes de calcio que aquí se presenta permite grabar, en una rebanada preparación aguda, la respuesta feromonal del ratón neuronas del OVN. Con este enfoque, la disección del animal a las neuronas vomeronasal es decir, con un poco de práctica, fácil de lograr y proporciona una preparación de tejidos de larga vida. Permite tiempo experimentos como las investigaciones farmacológicas o el estudio de la codificación de feromonas. Con esta técnica fisiológica, las grandes poblaciones, así como precisa subpoblaciones neuronales pueden ser analizados en particular. Además, este método puede ser fácilmente adaptada a los planteamientos de inmunohistoquímica o experimentos basados en colorantes calcio. El uso de estas metodologías combinadas seguramente permitirá la identificación de nuevos ligandos feromonal de los quimiorreceptores huérfano muchos expresaron en el órgano vomeronasal del ratón.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Queremos agradecer especialmente a Monique Nenniger Tosato por su excelente apoyo técnico, así como Chatton Jean-Yves de su asesoramiento científico y la plataforma de imagen CIF de la UNIL para el equipo de microscopio. El financiamiento fue proporcionado por la Fundación Nacional Suiza de Ciencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
References
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