Hos möss är förmågan att detektera feromoner medieras huvudsakligen av vomeronasala orgel (VNO). Här är en akut vävnad bit förbereda VNO för att utföra kalcium avbildning beskrivs. Denna fysiologiska tillvägagångssätt gör det möjligt observationer av delpopulationer och / eller enskilda nervceller i en levande vävnad och är bekvämt för receptor-ligand identifiering.
Peter Karlson och Martin Lüscher använde termen feromon för första gången år 1959 en för att beskriva kemikalier som används för inom arten kommunikation. Feromoner är flyktiga eller icke-flyktiga kortlivade molekyler 2 utsöndras och / eller i biologiska vätskor 3,4, till exempel urin, en vätska känd för att vara en viktig källa till feromoner 3. Pheromonal kommunikation är inblandad i en rad viktiga djur modaliteter som anhörig interaktioner 5,6, hierarkiska organisationer 3 och sexuella interaktioner 7,8 och är därmed direkt korrelerade med överlevnaden för en viss art 9,10,11. Hos möss är förmågan att detektera feromoner medieras huvudsakligen av vomeronasala orgel (VNO) 10,12, en kopplad struktur ligger vid foten av näshålan och inneslutna i ett brosk kapsel. Varje VNO har en tubulär form med en lumen 13,14 gör att kontakten med externakemiska världen. Den sensoriska neuroepithelium är främst består av vomeronasala bipolär sensoriska neuron (VSNs) 15. Varje VSN sträcker sig en enda Dendrite till lumen som slutar i en stor dendritiska ratten med upp till 100 mikrovilli inblandade i kemiska upptäckt 16. Många subpopulationer av VSNs är närvarande. De är differentierade genom chemoreceptor de uttrycker och därmed eventuellt av ligand (s) de känner igen 17,18. Två huvudsakliga vomeronasala receptorn familjer V1Rs och V2Rs 19,20,21,22, består av respektive 240 23 och 120 24 medlemmar och uttrycks i separata lager av neuroepithelium. Luktreceptorer (ORS) 25 och formyl receptorer peptid (FPRs) är 26,27 uttrycks också i VSNs.
Huruvida dessa neuronala delpopulationer använder samma nedströms signalväg för avkänning feromoner är okänd. Trots en viktig roll som spelas av ett kalcium-permeabla kanal (TRPC2) finns i mikrovilli av mogna nervceller 28 TRPC2 oberoende transduktion kanaler har föreslagits 6,29. På grund av det stora antalet neuronala delpopulationer och den säregna morfologi orgeln, farmakologiska och fysiologiska undersökningar av signalering element som finns i VNO är komplexa.
Här presenterar vi ett akut förberedelse vävnad bit av musen VNO som gör utredningar kalcium avbildning. Denna fysiologiska tillvägagångssätt gör iakttagelser i naturen av en levande vävnad, allmänna eller enskilda delpopulationer av VSNs tidigare laddade med Fura-2:00, en kalcium färgämne. Denna metod är också bra för att studera eventuella GFP-märkta feromon receptorn och är anpassningsbar för användning av andra fluorescerande kalcium sonder. Som ett exempel använder vi här ett VG mus linje 30, som översättningen av feromon V1rb2 receptorn är kopplad till ett uttryck av GFP genom en polycistronic strategi. </p>
Även kalcium avbildande metod som presenteras här gör det möjligt att spela in, i en akut skiva förberedelserna, pheromonal svaren från mus VNO nervceller. Med detta synsätt är dissektion från djur till vomeronasala nervceller, med lite övning, lätt genomförbara och ger en lång levande vävnad förberedelse. Det låter tidskrävande experiment liknande farmakologiska undersökningar eller studier av pheromonal kodning. Med denna fysiologiska teknik kan stora populationer samt exakt neuronala subpopulationer analyseras specifikt. Dessutom kan denna metod enkelt anpassas till immunhistokemiska metoder eller experiment baserade på andra kalcium färgämnen. Användningen av dessa kombinerade metoder kommer säkert att kunna identifiera nya pheromonal ligander för de många föräldralösa chemoreceptors uttrycks i musen vomeronasala orgel.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka särskilt Monique Nenniger Tosato för hennes utmärkta teknisk support samt Jean-Yves Chatton för hans vetenskapliga råd och avbildning CIF plattform UNIL för mikroskopet utrustning. Finansieringen kom från den schweiziska National Science Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |