Summary
En metode for å overvåke ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler er beskrevet. En degron-destabilisert GFP-(GFP-DGN) og en stabil GFP-dgnFS fusjonsprotein genereres og transduced inn i cellen ved hjelp av en lentiviral ekspresjonsvektor. Denne teknikken gjør det mulig å generere en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS uttrykke cellelinje der ubiquitin-proteasom aktivitet kan lett vurdert ved hjelp epifluorescence eller flowcytometri.
Abstract
Proteasome er den viktigste intracellulære organeller involvert i proteolytisk nedbrytning av unormale, misfolded, skadet eller oksidert proteiner 1, 2. Vedlikehold av proteasome aktivitet ble innblandet i mange viktige cellulære prosesser, som celle stressrespons 3, cellesyklus regulering og cellulær differensiering 4 eller i immunsystemet respons fem. Dysfunksjon av ubiquitin-proteasom systemet har vært knyttet til utvikling av svulster og nevrodegenerative sykdommer 4, 6. I tillegg ble en reduksjon i proteasom aktivitet funnet som en funksjon av cellulær senescence og organismebiologi 7 aldring, 8, 9, 10. Her presenterer vi en metode for å måle ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjelp av en GFP-DGN fusion protein. Å være i stand til å overvåke ubiquitin-proteasom i levende primære celler, konstruerer komplementær DNA som koder for et grønt fluorescerende protein (GFP)-DGN fusjonsprotein (GFP-DGN og ustabil) og en variant som bærer en frameshift mutasjon (GFP-dgnFS, stabil 11) er satt inn i lentiviral ekspresjonsvektorer. Vi foretrekker denne teknikken over tradisjonelle transfeksjon teknikker fordi det garanterer en meget høy transfeksjon virkningsgrad uavhengig av celletypen eller alderen på giveren. Forskjellen mellom fluorescens som vises av GFP-dgnFS (stabil) protein og destabilisert protein (GFP-DGN) i fravær eller nærvær av proteasominhibitor kan brukes til å estimere ubiquitin-proteasom aktivitet i hvert enkelt cellestamme. Disse forskjellene kan overvåkes av epifluorescence mikroskopi eller kan måles ved strømningscytometri.
Protocol
1. Plasmid Anlegg
- Bestill custom oligo-nukleotider koding for DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) og for dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) og ligere det inn i pEGFP-C1 vektor for å få sammensmeltingen av GFP med DGN / dgnFS (figur 1).
- Forsterke kodesekvensen for GFP-DGN og GFP-dgnFS ved PCR i henhold til protokollen fra pENTR Directional TOPO Kloning Kit og fortsette med pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (figur 6).
2. Virus Produksjon
- Dagen før transfeksjon (dag 1) frø ut HEK 293FT celler i en T75 kolber, slik at de vil være 90-95% confluent den dagen transfeksjon.
- På dagen for transfeksjon fortynne 36 pl lipofectamine 2000 Reagens i 1,5 ml DMEM uten serum og antibiotika i et 15 ml Falcon. Bruk en annen 15 ml falk og fortynne 3 mikrogram pLenti6/V5 bærer komplementære DNA konstruere for enten GFP -DGN eller GFP-dgnFS, 2,5 ug konvolutt koding plasmid pMD2.G og 7,5 ug vektor psPAX2 ryggrad i 1,5 ml DMEM uten serum og antibiotika. Etter 5 min fortynnet DNA kombineres med det fortynnede lipofectamine 2000 Reagens.
- Inkuber blandingen i 20 min ved romtemperatur for å tillate DNA-lipofectamine komplekser til skjemaet.
- Fjern mediet for HEK 293FT celler, erstatte den forsiktig med 7 ml medium (uten antibiotika) og legg til DNA-lipofectamine blandingen i kolben og rock den frem og tilbake for å blande (Dag 2). Inkuber kolben over natten ved 37 ° C i en fuktet 5% CO 2 inkubator.
- Endre medium neste dag (10 ml medium uten antibiotika, dag 3).
- Etter 48 hr (dag 5) innhøsting supernatant sentrifuge ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur og filtrer supernatanten gjennom et 0,45 um PVDF filter.
Kultur medium - DMEM (HEK 293FT)
telt "> DMEM10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamin
1 mM MEM Sodium Pyruvate
1% Pen-Strep (valgfritt)
500 ug / ml Geneticin (valgfritt)
3. Virus Konsentrasjon av polyetylenglykol (PEG) Nedbør
- Tilsett en volum Polyetylenglykol oppløsning (50 mM Polyetylenglykol, 41 mM NaCl, autoklav, pH = 7.2; PEG) til fire volumer av supernatant og inkuber i 2 timer ved 4 ° C. Bland det hver 20-30 min ved å snu.
- Spinne ned ved 1500 xg i 30 minutter ved 4 ° C. En hvit pellet bør være synlig.
- Aspirer supernatanten og sentrifuger igjen ved 1500 xg i 5 min ved 4 ° C. Aspirer gjenværende PEG løsning.
- Resuspender pelleten i medium eller fosfat-bufret saltvann (PBS) ved å pipettere opp og ned og kraftig vortex i 20 til 30 sekunder. Som en retningslinje bruker 500 ul for en T75 kolbe og delmengde det til 100 ul. Oppbevar viruset ved -80 ° C.
- Seed ut 5 x 10 4 U2-OS celler til hver brønn i en 6-brønns plate dagen før transfeksjon.
- På dagen for transfeksjon fjerne dyrkningsmediet og erstatte den ved 1 ml DMEM inneholdende 8 ug / ml polybren (hexadimethrine bromid). Fortynn konsentrert virus supernatant 1:10 og 1:100 og tilsett 1 ul hver til en brønn. For høyere konsentrasjoner virus bruker 1 pl, 5 pl og 10 pl konsentrert virus supernatant for gjenværende brønner. En brønn som er igjen som en positiv kontroll.
- Følgende dag erstatte mediet med 2 ml DMEM.
- Start med valget neste dag. Påfør 10 ug / ml Blasticidin på hver brønn. Erstatte antibiotika som inneholder medium annenhver dag.
- Ca 6-7 dager etter oppstart av utvalget de untransduced cellene er døde. For farging vaske cellene tre ganger med PBS og dekke cellene med krystallfiolett (10 mg / l krystallfioletti 20% etanol) og inkuber i 5-10 minutter ved romtemperatur. Aspirat krystallfiolett (kan gjenbrukes noen ganger) og skyll brønnene to ganger med DDH 2 O og tørk platen.
- Tell koloniene og multiplisere med 1000 og den tilsvarende fortynning (figur 7). Denne prosedyren gjør det mulig å beregne transfeksjon enheter (TU) av virus / ml.
Kultur medium - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6MM L-glutamin
1% Pen-Strep
5. Transduksjon av humane diploide fibroblaster (Denne prosedyren kan brukes for en hvilken som helst celletype.)
- Seed ut 5 × 10 4 humane diploide fibroblaster (HDFs) til 6-brønn plater dagen før transduksjon.
- Bruk en multiplisitet av infeksjon av to sammen med 8 ug / ml polybren som transduksjon enhancer i totalt en milliliter.
- Endre medium neste dag.
- Nårcellene er ved 70-80% av sammenflyting begynne markeringen med 10 ug / ml blasticidin. Etter valg er fullført (ikke mer untransfected celler dør) utvidelse av cellene kan starte og cellene er klare for eksperimenter. Kronisk utvalg med blasticidin gjør det mulig å generere en stabil cellelinje overekspresjon GFP-DGN eller GFP-dgnFS fusjonsproteiner, klar til å måle proteasome aktivitet. Denne prosedyren har en meget høy transfeksjon virkningsgrad uavhengig av celletype.
6. Måling ved strømningscytometri
- Seed ut 1 × 10 5 celler (bærer enten GFP-DGN eller GFP-dgnFS) dagen før forsøket.
- Treat kontrollceller 3t før målingen med proteasominhibitor, f.eks 100 ug / ml LLNL.
- Vask to ganger med PBS og høste cellene ved anvendelse av 0,5 ml av trypsin. Å stoppe trypsinisation bruke 4,5 ml dyrkingsmedium og overføre cellene til en 15 ml Falcon.
- Spin than cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer mediet, resuspender cellene i PBS og spinne ned igjen ved 300 xg i 5 minutter ved 37 ° C.
- Aspirer PBS, resuspender i 400 pl FACS buffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl-2, pH = 7,4) og overføre cellene til FACS rør.
- Holde cellene på is og måle prøver med flowcytometri. Cellene bør ikke lagres lenger enn 30 min ved 4 ° C.
7. Representant Resultater
GFP-DGN fusjonsprotein bærer en sekvens som er rettet mot proteasome og derfor er proteinet umiddelbart degradert, det tilsvarer nedgangen i GFP fluorescens signal. Den frameshift mutant (GFP-dgnFS) bærer en mutert versjon av denne sekvensen og er ikke forringes av proteasomet, det fører til høyere grønn fluorescens. For disse grunner, transduced unge HDFs med forventet høy proteasome aktivitet og med GFP-dgn viser en lav (6% positive celler) fluorescens-signal i både flowcytometri måling og i epifluorescence (Figur 2A og B, 3 Figur). Det samme HDFs transduced med GFP-dgnFS vise 39,7% av positive celler. Behandlingen av cellene med proteasominhibitor LLNL (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) hevet signalet til maksimum 62,9% i begge, GFP-DGN og GFP-dgnFS celler (figur 2A og B ).
Å bestemme mulig nedgang i proteasome aktivitet i alderen menneskelig hud prøvene ble dermal fibroblaster isolert fra unge, middelaldrende og gamle givere smittet med GFP-DGN og GFP-dgnFS, som beskrevet ovenfor og dyrket til samme passasje nummeret før analyse av flyt cytometri. I disse eksperimentene, en klar økning i GFP signal mellom unge individer (11,2 ± 0,88% GFP-positive celler) og middelaldrende givere (20,4 ± 2,27% GFP-positive celler, P = 0.003) har blitt observert, noe som indikerer en reduksjon i Proteasome aktivitet i prøver tatt fra alderen givere 7 (figur 4). Ingen ytterligere reduksjon i proteasom aktivitet ble observert i fibroblaster isolert fra eldste individer (figur 4). Fluorescensintensitet for GFP-dgnFS var i alle tilfeller ~ 90% (data ikke vist) som indikerer en høy transfeksjon effektivitet for de tre ulike aldersgrupper.
Figur 1. GFP-DGN og GFP-dgnFS sekvens. Viste er 3'-enden av GFP (grønt) multippel kloning stedet for det pEGFP-CL1 vektor (grå) og DGN / dgnFS sekvens (rød).
Figur 2. Flowcytometri analyse av GFP-DGN og GFP-dgnFS humane diploide fibroblaster. A. Young menneskelige forhud fibroblaster (HFF-2) var infisert med lentiviral vektorer som bærer en grønn fluorescerende protein (GFP)-DGN genet eller en GFP-dgnFS (frameshift) konstruere, som indikert og analysert for GFP fluorescens hjelp flowcytometri (FACS Canto II, Becton Dickinson). Hvor indikert, ble celler også behandlet for 3t med proteasominhibitor N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLNL). Infiserte celler ble anvendt som en kontroll. Eksperimenter ble utført i triplicates. B. data er representative for tre uavhengige eksperimenter. Tallene gjenspeiler mengden av GFP positive celler. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Fluorescensmikroskopi analyse av GFP-DGN og GFP-dgnFS HFF-2 celler. Young HFF-2 ble behandlet som i Figur 2. Hos 9 dager etter infeksjon ble celler visualized av fluorescens og fase kontrast mikroskopi.
Figur 4. Endringer i proteasome i menneskelig hud aldring. Den menneskelige forhud fibroblaster fra ni ulike givere i de angitte aldersgrupper var minimal utvidet og infisert med lentiviral konstruksjoner som koder for GFP-DGN. Hos 9 dager etter infeksjon ble cellene analysert ved strømningscytometri. Data ble innhentet på tre prøver per aldersgruppe i duplikater (± SE).
Figur 5. Eksperimentell tilnærming. Custom-oligo nukleotider for DGN og dgnFS er klonet inn i pEGFP-C1 vektor og virus er produsert for hver konstruksjon med HEK 293FT celler. Titer av virus bestemmes. Celler er transduced med viruset og utvidet. Etter den favoriserte behandlingen cellene analyseresfor fluorescens-signal ved strømningscytometri.
Figur 6. Kart over Plenti GFP-DGN. Kartet over pLenti6/V5-DEST vektor inkludert GFP-DGN sekvens vises. Forkortelser: PCMV (CMV promoter), GFP-DGN (sekvens av GFP-DGN), P SV40 (SV40 tidlig promoter), EM7 (EM7 promoter), Blasticidin (Blasticidin motstand genet), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR med slettet U3 region), SV40 pA (SV40 polyadenyleringssignalet), Ampicillin (ampicillinresistens-genet), pUC ori (pUC opprinnelse), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR hybrid promoter), Ψ (HIV-1 Ψ emballasje signal ), RRE (HIV-1 Rev respons element).
Figur 7. U2-OS titering plate. U2-OS ble utsådd ut på en 6-brønners plate og transfektert med forskjellige virus konsentrasjoner (fortynning av 1/100 og 1/10, 1, 5 og 10 pl av concentrated viral supernatant). En brønn ble brukt som untransfected kontroll (NT). Etter 6-7 dager ble cellene farget med krystallfiolett og lufttørket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første publikasjonen med grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter substrat for ubiquitin-proteasom aktivitet ble publisert i 2000 12. Siden da har GFP blitt et vanlig verktøy for å visualisere cellulære aktiviteter, spesielt ubiquitin-proteasom prosess. Å overvåke ubiquitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen mus modell med en GFP-baserte reporter har blitt innført 13. Ytterligere in vivo undersøkelser etablert en transgen mus modell med en lignende degron-destabiliseres GFP reporter som brukt i denne publikasjonen 14.
Dessverre har GFP som reporter noen ufullkommenhet som har blitt vist av Dantuma m.fl.. Og Bowman et al. 12,15. Først, kan destabiliseres GFP akkumulere uten hemming av proteasomet grunn av ukjente årsaker. Som ubiquitin-proteasom maskineri er et system som har funksjonalitet er avhengig av flere trinn, adisturbance før degradering kan føre til akkumulering av reporteren substratet og resultere i falske positive effekter 12. Sekund, GFP-baserte reporter underlag er på grunn av deres korte halveringstider følsom for endringer i transkripsjon og oversettelse. Enhver endring i GFP fluorescens kan derfor være et resultat av redusert eller økt syntese og oversettelse 15. Disse problemene har blitt løst i andre studier av modifikasjoner av GFP som følger:
Proteasom aktivitet ble funnet å være redusert i cellulær senescence og organismebiologi 7 aldring, 8, 9, 10. I feltet av aldring forskning fokuseres hovedsakelig på fjerning av oksyderte proteiner der proteasomet spiller en sentral rolle, og det er ingen bevis på at protein ubiquitylation forut nedbrytning i dette tilfellet 2. Tidligere arbeid har også vist at bruk av GFP med en mutert uncleavable ubiquitin del er egnet til å studere den komplekse prosessen protein degradering 16. Dette GFP-konstruksjon gir mulighet til å overvåke proteasome aktivitet uten den potensielle innflytelse til sin aktivitet via forstyrrelser i ubiquitin maskiner.
I dette arbeidet har vi brukt en degron-destabilisert GFP-baserte reporter protein (GFP-DGN) for å overvåke ubiquitin-proteasom i levende humane diploide fibroblaster. Å ha en oversikt over transfeksjon effektivitet, funksjonalitet og transkripsjon / oversettelse nivåer av GFP-DGN reporter, ble flere aktuelle kontroller inkludert. Vi brukte unge ubehandlede GFP-DGN transfekterte fibroblaster å vise at det er nesten ingen grønn fluorescens synlig og proteasome funksjon påvirkes ikke. Å validere, at signalet øker med inhibering av proteasomet, behandlet vi GFP-DGN transfekterte fibroblaster med en proteasominhibitor å se akkumulering av GPF etter hemming. Som et tredje kontroll brukte vi GFP-dgnFS. Med denne konstruksjonen kan vi vise Overall transfeksjon effektivitet som kan variere fra cellestamme til cellestamme og med alle tre kontrollene vi har oversikt over syntese rate av konstruksjoner i cellen.
Metoden som presenteres her muliggjør en måle raskt og enkelt ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler. En stabil overuttrykte GFP reporteren substratet kan oppnås med forskjellige teknikker 17. I denne publikasjonen er transfeksjon av GFP-DGN cDNA inn i cellene oppnådd ved lentiviral system som gir en stabil uttrykk. I tillegg muliggjør bruken av dette systemet høy transfeksjon virkningsgrad uavhengig av celletype, celler metabolsk tilstand eller donor alder 7. Vi har med hell brukt denne protokollen for å introdusere DNA til endotelceller som andre metoder for transfeksjon mislyktes 18 år. Likevel viste tidligere eksperimenter som celler som er ekspandert lengre i kultur viser en lavere fluorescenssignal enn ferskt transfektert celler, muligens på grunn av lengre seleksjonstrykk.
PEG ventet brukes til å øke titeren av den transformerende enheter per ml (TU / ml). Dersom gode titere nås (over 5 x 10 5 TU / ml), kan PEG ventet utelates. Et viktig skritt i løpet av PEG nedbør er å unngå kraftig suspendere eller pipettering som genererer luftbobler. Det kan inaktivere virus partikler og betydelig redusere transfeksjon effektivitet.
Ved bruk proteasomhemmere a priori eksperimenter bør utføres. Den endelige konsentrasjonen brukt og inkubasjonstid er celletype avhengige og må bestemmes eksperimentelt. Tidligere observasjoner på HFF-2 celler viste at 3t inkubasjon med LLNL bør ikke overskrides på grunn av 1) de giftige effektene av inhibitor 2) for høy GFP signal som kan nås, eller 3) bivirkninger av proteasomhemmingen over lengre time perioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av: National Research Network on Aging (NFN S93) av den østerrikske Science Foundation (FWF), EU-kommisjonen integrerte prosjekter MiMAGE og PROTEOMAGE, Nederland Genomics Initiative / nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NGI / NWO, 05040202 og 050 - 060-810 NCHA), EU finansiert Network of Excellence Levetid (FP6 036894), og Innovasjon forskningsprogram på Genomics (SenterNovem, IGE01014 og IGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
