Summary
En metod för att övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler beskrivs. En degron-destabiliserade GFP-(GFP-DGN) och en stabil GFP-dgnFS fusionsprotein genereras och transduceras in i cellen med användning av en Lentiviral expressionsvektor. Denna teknik gör det möjligt att generera en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS uttryckande cellinje i vilken ubiquitin-proteasom aktivitet kan enkelt bedömas med epifluorescens eller flödescytometri.
Abstract
Proteasom är den viktigaste intracellulära organell involverade i den proteolytiska nedbrytningen av abnorma, felveckade, skadade eller oxiderade proteiner 1, 2. Underhåll av proteasom aktivitet inblandad i många viktiga cellulära processer, såsom cellens stressrespons 3, cellcykelreglering och cellulär differentiering 4 eller immunsystemet 5. Dysfunktion i den ubikitin-proteasom-systemet har kopplats till utvecklandet av tumörer och neurodegenerativa sjukdomar 4, 6. Dessutom observerades en minskning proteasom aktivitet hittades som en funktion av cellulärt åldrande och organismbiologi åldrande 7, 8, 9, 10. Här presenterar vi en metod för att mäta ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler med hjälp av en GFP-DGN fusionsprotein. För att kunna övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande primära celler, konstruerar komplementär DNA som kodar för ett grönt fluorescerande protein (GFP)-DGN fusionsprotein (GFP-DGN, unstable) och en variant som bär en ramskiftesmutation (GFP-dgnFS, stabil 11) sätts in i Lentiviral expressionsvektorer. Vi föredrar denna teknik jämfört med traditionella transfektionstekniker eftersom det garanterar en mycket hög transfektionseffektivitet oberoende av celltyp eller ålder hos givaren. Skillnaden mellan fluorescens visas av GFP-dgnFS (stabil) protein och den destabiliserade proteinet (GFP-DGN) i frånvaro eller närvaro av proteasomhämmare kan användas för att uppskatta ubiquitin-proteasom aktivitet i varje enskilt cellstam. Dessa skillnader kan övervakas genom epifluorescensmikroskopi eller kan mätas genom flödescytometri.
Protocol
1. Plasmidkonstruktion
- Beställ anpassade oligo-nukleotider som kodar för DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) och för dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) och ligera det in i pEGFP-C1 vektorn att erhålla fusion av GFP med DGN-/ dgnFS (figur 1).
- Förstärk den kodande sekvensen för GFP-DGN och GFP-dgnFS med PCR enligt protokollet av pENTR Directional TOPO Kloning Kit och fortsätta med pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Figur 6).
2. Virusproduktion
- Dagen före transfektion (dag 1) frö ut HEK 293FT celler i en T75-kolvar, så att de kommer att vara 90-95% sammanflytande på dagen för transfektion.
- På dagen för transfektion späd 36 | il lipofektamin 2000 Reagens i 1,5 ml DMEM utan serum och antibiotika i en 15 ml Falcon. Använd en annan 15 ml Falcon och späd 3 ug pLenti6/V5 bär komplementära DNA-konstruktionen för antingen GFP -DGN-eller GFP-dgnFS, 2,5 pg kuvert kodande plasmid pMD2.G och 7,5 pg vektorryggrad psPAX2 i 1,5 ml DMEM utan serum och antibiotika. Efter 5 min utspädda DNA kombineras med den utspädda lipofektamin 2000 Reagens.
- Inkubera blandningen i 20 min vid rumstemperatur för att låta DNA-lipofektamin komplex till formen.
- Ta bort mediet HEK 293FT celler, byt ut den försiktigt med 7 ml medium (utan antibiotika) och lägga till DNA-Lipofectamine blandningen i kolven och rock tillbaka och tillbaka för blandning (dag 2). Inkubera kolven natten vid 37 ° C i en fuktad 5% CO 2 inkubator.
- Ändra medium nästa dag (10 ml medium utan antibiotika, Dag 3).
- Efter 48 timmar (dag 5) skörd supernatanten, centrifugera vid 300 xg under 5 minuter vid rumstemperatur och filtrera supernatanten genom ett 0,45 um PVDF-filter.
Odlingsmedium - DMEM (HEK 293FT)
tält "> DMEM10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamin
1 mM MEM natriumpyruvat
1% Pen-Strep (tillval)
500 pg / ml Geneticin (valfritt)
3. Viruskoncentrationen genom polyetylenglykol (PEG) Utfällning
- Tillsätt en volym lösning Polyetylenglykol (50 mM Polyetylenglykol, 41 mM NaCl, autoklav, pH = 7,2, PEG) till fyra volymer supernatant och inkubera under 2 timmar vid 4 ° C. Blanda försiktigt det varje 20-30 min genom att vända.
- Centrifugera ner vid 1500 xg i 30 minuter vid 4 ° C. En vit pellets ska vara synliga.
- Aspirera supernatanten och centrifugera igen vid 1500 x g under 5 min vid 4 ° C. Aspirera återstående PEG-lösningen.
- Resuspendera pelleten i mediet eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att pipettera upp och ned och kraftfullt vortexa i 20 till 30 sekunder. Som en riktlinje använder 500 ul för en T75 kolv och alikvot till 100 ^. Förvara viruset vid -80 ° C.
- Frö ut 5 x 10 4 U2-OS-celler till varje brunn i en 6-brunnsplatta dagen innan transfektion.
- På dagen för transfektion avlägsna odlingsmediet och ersätta den med 1 ml DMEM innehållande 8 pg / ml polybren (hexadimetrinbromid). Späd den koncentrerade virussupernatanten 1:10 och 1:100 och tillsätt 1 il vardera till en brunn. För högre koncentrationer virus använder 1 il, 5 pl och 10 pl koncentrerad virussupernatanten för de återstående brunnarna. En brunn kvar som en positiv kontroll.
- Följande dag ersätta mediet med 2 ml DMEM.
- Börja med valet nästa dag. Applicera 10 | ig / ml Blasticidin på varje brunn. Byt antibiotikum medium varannan dag.
- Cirka 6-7 dagar efter påbörjad valet att otransducerade cellerna är döda. För färgningen tvätta cellerna tre gånger med PBS och täcka cellerna med kristallviolett (10 mg / l kristallvioletti 20% etanol) och inkubera under 5-10 minuter vid rumstemperatur. Sug kristallviolett (kan återanvändas några gånger) och skölj brunnarna två gånger med DDH 2 O och torka plattan.
- Räkna kolonierna och multiplicera med 1.000 och motsvarande utspädning (figur 7). Detta förfarande gör det möjligt att beräkna transfektion enheter (TU) av viruset / ml.
Odlingsmedium - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6mM L-glutamin
1% Pen-Strep
5. Transduktion av humana diploida fibroblaster (Detta förfarande kan användas för vilken celltyp som helst.)
- Frö ut 5 x 10 4 humana diploida fibroblaster (HDFS) till 6-brunnars plattor dagen före transduktion.
- Använd en infektionsmultiplicitet av två tillsammans med 8 pg / ml polybren i transduktion förstärkare i totalt en milliliter.
- Förändring medium nästa dag.
- Närcellerna är vid 70-80% av sammanflöde börja markeringen med 10 pg / ml blasticidin. Efter valet är klar (ingen mer otransfekterade celler dör) expansionen av cellerna kan starta och cellerna är redo för experiment. Kronisk val med blasticidin gör det möjligt att skapa en stabil cellinje som överuttrycker GFP-DGN eller GFP-dgnFS fusionsproteiner, redo att mäta proteasom aktivitet. Detta förfarande garanterar en mycket hög transfektionseffektivitet oberoende av celltypen.
6. Mätning genom flödescytometri
- Frö ut 1 x 10 5 celler (bär antingen GFP-DGN eller GFP-dgnFS) dagen före experimentet.
- Behandla kontrollceller 3 h före mätningen med proteasomhämmare, t.ex. 100 ug / ml llnl.
- Tvätta två gånger med PBS och skörda cellerna med användning av 0,5 ml trypsin. För att stoppa trypsinisering använda 4,5 ml odlingsmedium och överföra cellerna till ett 15 ml Falcon.
- Spin than celler vid 300 x g under 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera mediet, resuspendera cellerna i PBS och centrifugera ner igen vid 300 xg under 5 minuter vid 37 ° C.
- Aspirera PBS, resuspendera i 400 ul FACS-buffert (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaClj, 2 pH = 7,4) och överföra cellerna till FACS-rör.
- Håll cellerna på is och mått prover med flödescytometri. Cellerna bör inte lagras längre än 30 minuter vid 4 ° C.
7. Representativa resultat
GFP-DGN fusionsprotein uppbär en sekvens som är riktad till proteasomen och därför proteinet omedelbart ned, det motsvarar minskningen i GFP-fluorescens-signalen. Den ramskifte mutanten (GFP-dgnFS) uppbär en muterad version av denna sekvens och inte bryts ned av proteasom, det leder till högre grön fluorescens. Av dessa skäl transducerade unge HDFS med förväntad hög proteasom aktivitet och med GFP-dgn visar en låg (6% positiva celler) fluorescenssignal i både flödescytometri mätning och i epifluorescens (Figur 2A och B, figur 3). Samma HDFS transducerade med GFP-dgnFS visa 39,7% av positiva celler. Behandlingen av cellerna med proteasomhämmare llnl (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) höjde signalen till högst 62,9% i båda, GFP-DGN-och GFP-dgnFS celler (Figur 2A och B ).
För att bestämma eventuell nedgång i proteasom aktivitet i åldrade människor hudprover har hudfibroblaster isolerade från unga, medelålders och gamla givare infekterade med GFP-DGN och GFP-dgnFS, som beskrivits ovan, och odlas på samma passagen nummer före analys med flöde cytometri. I dessa experiment en tydlig ökning av GFP-signal mellan unga individer (11,2 ± 0,88% GFP-positiva celler) och medelålders givare (20,4 ± 2,27% GFP-positiva celler, p = 0,003) har observerats, vilket tyder på en minskning Proteasome aktivitet i prover erhållna från åldrade donatorer 7 (Figur 4). Ingen ytterligare minskning i proteasom aktivitet observerades i fibroblaster isolerade från äldsta individer (Figur 4). Fluorescensintensiteten för GFP-dgnFS var i samtliga fall ~ 90% (data ej visade) vilket indikerar en hög transfektionseffektivitet för de tre olika åldersgrupper.
Figur 1. GFP-DGN och GFP-dgnFS sekvens. Visas är 3'-änden av GFP (grönt) det multipla kloningsstället av pEGFP-CL1 vektor (grå) och DGN / dgnFS sekvens (röd).
Figur 2. Flödescytometrianalys av GFP-DGN-och GFP-dgnFS humana diploida. A. Young humana förhudsfibroblaster (HFF-2) infekterades med lentivirala vektorer som bär en grönt fluorescerande protein (GFP)-DGN-genen eller en GFP-dgnFS (ramskifte) konstruera, såsom anges och analyserades för GFP-fluorescens med användning av flödescytometri (FACS Canto II, Becton Dickinson). Där så anges, cellerna behandlades också under 3 timmar med proteasomhämmare N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (llnl). Oinfekterade celler användes som en kontroll. Experiment utfördes i triplikat. B. Data är representativa för tre oberoende experiment. Siffrorna återspeglar mängden GFP positiva celler. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Fluorescensmikroskopi analys av GFP-DGN-och GFP-dgnFS HFF-2-celler. Unga HFF-2 behandlades såsom i figur 2. Vid 9 dagar efter infektion, var cellerna motisualized genom fluorescens och faskontrast mikroskopi.
Figur 4. Förändringar i proteasom aktivitet i mänsklig hud åldrande. De humana förhudsfibroblaster från nio olika givare i de angivna åldersgrupperna var minimalt expanderade och infekterade med lentivirala konstruktioner som kodar för GFP-DGN. Vid 9 dagar efter infektion, analyserades cellerna genom flödescytometri. Uppgifterna erhölls på tre prover per åldersgrupp i dubbletter (± SE).
Figur 5. Experimentell metod. Är specialanpassade oligonukleotider för DGN och dgnFS klonades i pEGFP-C1 vektor och virus produceras för varje konstruktion med HEK 293FT celler. Titern av virusen bestäms. Celler transduceras med viruset och expanderades. Efter den gynnade behandlingen cellerna analyserasför fluorescenssignal genom flödescytometri.
Figur 6. Karta över Plenti GFP-DGN. Kartan över det pLenti6/V5-DEST vektor inkluderande GFP-DGN sekvensen visas. Förkortningar: pCMV (CMV promotor), GFP-DGN (sekvens av GFP-DGN), P SV40 (SV40 tidig promotor), EM7 (EM7 promotor), Blasticidin (Blasticidin resistensgen), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR med utgår U3-regionen), SV40-pA (SV40 polyadenyleringssignal), ampicillin (ampicillinresistensgen), pUC ori (pUC), pRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR hybridpromotor), Ψ (HIV-1 Ψ packningssignal ), RRE (HIV-1 Rev responselement).
Figur 7. U2-OS-bestämning av antikroppnivå plåt. U2-OS såddes ut på en 6-brunnars platta och transfekterades med olika virus koncentrationer (spädning av 1/100 och 1/10, 1, 5 och 10 | il av samarbetetncentrated viral supematant). En brunn användes som otransfekterade kontroll (NT). Efter 6-7 dagar, färgades cellerna med kristallviolett och lufttorkades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den första publikationen med grönt fluorescerande protein (GFP) som reporter substrat för ubiquitin-proteasom aktivitet publicerades 2000 12. Sedan dess har GFP blivit ett vanligt verktyg för att visualisera cellulära aktiviteter, speciellt ubiquitin-proteasom process. För att övervaka ubikitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen musmodell med en GFP-baserad reporter har införts 13. Ytterligare in vivo-forskning, inrättat en transgen musmodell med en liknande degron-destabiliseras GFP reporter som används i denna publikation 14.
Olyckligtvis har GFP som en reporter viss ofullkomlighet som har visats av Dantuma et al. Och Bowman et al. 12,15. Först, kan destabiliseras GFP ansamlas utan inhibering av proteasomen okänd anledning. Som ubiquitin-proteasom maskiner är ett system vars funktionalitet är beroende av flera steg, annonsisturbance före nedbrytningen kan leda till ackumulering av reportern substratet och resulterar i falskt positiva effekter 12. Det andra, GFP-baserade reporter substrat är på grund av deras korta halveringstider känslig för förändringar i transkription och translation. Alla förändringar i GFP fluorescens kan därför vara ett resultat av minskad eller ökad syntes och översättning 15. Dessa problem har tagits upp i andra studier av modifieringar av GFP som följer:
Proteasom aktiviteten befanns vara minskade i cellulärt åldrande och organismbiologi åldrande 7, 8, 9, 10. Inom området för åldrande forskning ligger fokus främst på att avlägsna oxiderade proteiner där proteasom spelar en viktig roll, och det finns inga avgörande bevis för att protein ubiquitylation föregår nedbrytningen i det här fallet 2. Tidigare arbete har också visat att användningen av GFP med en muterad uncleavable ubiquitindelen är lämplig att studera den komplexa processen av protein nedbrytning 16. Detta GFP-konstruktion ger möjlighet att övervaka proteasom verksamhet utan den potentiella påverkan på dess verksamhet genom störningar i ubiquitin maskiner.
I detta arbete använde vi en degron-destabiliserade GFP-baserad reporter protein (GFP-DGN) för att övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande humana diploida fibroblaster. Att ha en överblick över transfektion effektivitet, funktionalitet och transkription / translation nivåer av GFP-DGN reporter har flera lämpliga kontroller ingår. Vi använde unga obehandlade GFP-DGN transfekterade fibroblaster för att visa att det finns nästan ingen grön fluorescens synlig och proteasomfunktion påverkas inte. För att validera, att signalen ökar med inhibering av proteasomen, behandlade vi GFP-DGN transfekterade fibroblaster med en proteasom-inhibitor för att se ackumuleringen av GPF efter inhibering. Som tredjedel kontroll använde vi GFP-dgnFS. Med denna konstruktion kan vi visa Overall transfektion effektivitet som kan skilja sig från cellstammen till cellstam och med alla tre kontroller har vi en översikt över synteshastigheten av konstruktionerna i cellen.
Den metod som presenteras här gör det möjligt för användaren att mäta enkelt och snabbt ubikitin-proteasom aktivitet i levande celler. En stabil överexpression av GFP reporter substratet kan uppnås med olika tekniker 17. I denna publikation transfektion av GFP-DGN-cDNA i cellerna uppnås genom Lentiviral system som ger en stabil uttryck. Dessutom möjliggör användning av detta system med hög transfektionseffektivitet oberoende av celltyp, cell metabolisk tillstånd eller donatorns ålder 7. Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att introducera DNA till endotelcellerna som andra metoder för transfektion misslyckades 18. Ändå visade tidigare försök att celler som expanderas längre i kultur visar en lägre fluorescenssignal än färskt transfekterade celler möjligen på grund av den längre selektionstryck.
PEG utfällning används för att öka titern av de transformerande enheter per ml (TU / ml). Om goda titrar uppnås (över 5 x 10 5 TU / ml), kan PEG-utfällning utelämnas. Ett viktigt steg under PEG-fällning är att undvika kraftig avbryta eller pipettering som genererar luftbubblor. Den kan inaktivera viruspartiklar och signifikant minska transfektionseffektivitet.
Vid användning av proteasomhämmare a priori experiment ska utföras. Den slutliga koncentration som användes och inkubationstid är celltyp beroende och måste bestämmas experimentellt. Tidigare iakttagelser om HFF-2-celler avslöjade att 3h inkubation med llnl inte bör överskridas på grund av 1) de toxiska effekterna av inhibitorn 2) för hög GFP signal som kan nås, eller 3) biverkningar av proteasom-inhibition än längre time perioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av: National Research Network on Aging (NFN S93) av den österrikiska Science Foundation (FWF), Europeiska kommissionen integrerade projekt MiMAGE och PROTEOMAGE, Nederländerna Genomics Initiative / Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NGI / NWO, 05.040.202 och 050 - 060-810 NCHA), det EU-finansierade Network of Excellence Lifespan (FP6 036.894) och innovationsinriktade forskningsprogram om Genomics (SenterNovem, IGE01014 och IGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
