Summary
Fremgangsmåde til overvågning Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler er beskrevet. En degron-destabiliseret GFP-(GFP-DGN) og en stabil GFP-dgnFS fusionsprotein genereres og transduceres ind i cellen under anvendelse af en lentiviral ekspressionsvektor. Denne teknik gør det muligt at generere en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS udtrykkende cellelinie, hvori Ubiquitin-proteasom aktivitet kan let vurderes ved hjælp af epifluorescens eller flowcytometri.
Abstract
Proteasom er den vigtigste intracellulære organel involveret i den proteolytiske nedbrydning af unormale, fejlfoldede, beskadigede eller oxiderede proteiner 1, 2. Vedligeholdelse af proteasom aktivitet blev impliceret i mange vigtige cellulære processer, ligesom celle stress reaktion 3, cellecyklusregulering og cellulær differentiering 4 eller i immunsystemet respons 5. Dysfunktion af den ubiquitin-proteasom system er blevet forbundet med udviklingen af tumorer og neurodegenerative sygdomme 4, 6. Desuden blev et fald i proteasom aktivitet fundet som en funktion af cellulære ældning og organismal aldring 7, 8, 9, 10. Her præsenteres en metode til måling af ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjælp af en GFP-DGN fusionsprotein. At kunne overvåge Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende primære celler, komplementære DNA-konstruktioner der koder for et grønt fluorescerende protein (GFP)-DGN fusionsprotein (GFP-DGN og ustabil) og en variant bærer en rammeskift mutation (GFP-dgnFS, stabile 11) indsættes i lentivirale ekspressionsvektorer. Vi foretrækker denne teknik over traditionelle transfektionsteknikker, fordi den sikrer en meget høj transfektionseffektivitet uafhængig af den celletype eller alder donoren. Forskellen mellem fluorescens vises af GFP-dgnFS (stabilt) protein og destabiliseret protein (GFP-DGN) i fravær eller nærvær af proteasom inhibitor kan anvendes til at estimere Ubiquitin-proteasom aktivitet i hvert enkelt cellestamme. Disse forskelle kan overvåges ved epifluorescens-mikroskopi eller kan måles ved flowcytometri.
Protocol
1. Plasmid Construction
- For custom oligonucleotider kodende for DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) og for dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) og ligere det ind i pEGFP-C1 vektoren til opnåelse af fusion af GFP med DGN / dgnFS (figur 1).
- Forstærk den kodende sekvens for GFP-DGN og GFP-dgnFS ved PCR ifølge protokollen af pENTR Directional TOPO Cloning Kit og fortsætte med pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (figur 6).
2. Virusproduktion
- Dagen før transfektion (dag 1) frø ud HEK 293FT celler i en T75-kolber, således at de vil være 90-95% konfluente på dagen for transfektion.
- På dagen for transfektion fortyndet 36 pi af lipofectamin 2000 reagens i 1,5 ml DMEM uden serum og antibiotika i en 15 ml falcon. Brug en anden 15 ml falk og fortynd 3 pg pLenti6/V5 bærer den komplementære DNA-konstruktion for enten GFP -DGN eller GFP-dgnFS, 2,5 ug kuvert kodende plasmid pMD2.G og 7,5 ug vektorskelet psPAX2 i 1,5 ml DMEM uden serum og antibiotika. Efter 5 minutter den fortyndede DNA er kombineret med den fortyndede lipofectamin 2000 reagens.
- Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade DNA-Lipofectamin-komplekser til form.
- Fjern mediet af HEK 293FT-celler, erstatte det forsigtigt med 7 ml medium (uden antibiotika) og tilføje den DNA-lipofectamin blanding til kolben og rock det frem og tilbage for at blande (dag 2). Inkuber kolben natten over ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
- Skift medium den næste dag (10 ml medium uden antibiotika, dag 3).
- Efter 48 timer (dag 5) høst supernatant, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og filtreres supernatanten gennem et 0,45 um PVDF filter.
Dyrkningsmedium - DMEM (HEK 293FT)
telt "> DMEM10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamin
1 mM MEM natriumpyruvat
1% Pen-Strep (valgfrit)
500 ug / ml Geneticin (valgfrit)
3. Viruskoncentration ved polyethylenglycol (PEG) Precipitation
- Tilsættes et volumen Polyethylenglycol opløsning (50 mM Polyethylenglycol, 41 mM NaCl, autoklav, pH = 7,2; PEG) til fire volumener supernatant og inkuberes i 2 timer ved 4 ° C. Bland omhyggeligt det hver 20-30 min ved at vende.
- Spin ned ved 1500 x g i 30 minutter ved 4 ° C. En hvid pellet skal være synlig.
- Aspirer supernatanten og centrifugeres igen ved 1500 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer den resterende PEG-opløsning.
- Pellet resuspenderes i medium eller phosphatbufret saltvand (PBS) ved pipettering op og ned og kraftigt vortex for 20 til 30 sekunder. Som retningslinje bruger 500 pi for en T75-kolbe og alikvot det til 100 pi. Opbevare viruset ved -80 ° C.
- Frø ud 5 x 10 4 U2-OS-celler til hver brønd i en 6-brønds plade dagen inden transfektion.
- På dagen for transfektion fjernes dyrkningsmediet og erstattes med 1 ml DMEM indeholdende 8 ug / ml polybren (hexadimethrine bromid). Fortynd det koncentrerede virus supernatant 1:10 og 1:100 og der tilsættes 1 ul hver til en brønd. For højere virus koncentrationer bruger 1 pi, 5 pi og 10 ul koncentreret virus supernatant for de resterende brønde. En brønd efterlades som en positiv kontrol.
- Den følgende dag udskiftes mediet med 2 ml DMEM.
- Begynde med udvælgelsen den næste dag. Anvendes 10 ug / ml blasticidin på hver brønd. Erstatte den antibiotiske medium hver anden dag.
- Ca. 6-7 dage efter, at udvælgelsen af de untransduced celler er døde. Til farvning vaskes cellerne tre gange med PBS og dækker cellerne med krystalviolet (10 mg / l krystalvioleti 20% ethanol), og der inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Aspirer krystalviolet (kan genbruges et par gange) og skyl brøndene to gange med ddH 2 O og tørre pladen.
- Kolonierne og gange med 1000 og den tilsvarende fortynding (figur 7). Denne procedure gør det muligt at beregne transfektion (TU) af virus / ml.
Dyrkningsmedium - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6 mM L-glutamin
1% Pen-Strep
5. Transduktion af humane diploide fibroblaster (Denne fremgangsmåde kan anvendes til enhver celletype.)
- Frø ud 5 x 10 4 humane diploide fibroblaster (HDFS) til plader med 6 brønde dagen før transduktion.
- Brug en infektionsmultiplicitet på to sammen med 8 ug / ml polybren som transduktion middel i alt en milliliter.
- Skift medium den næste dag.
- HvornårCellerne er ved 70-80% konfluens begyndelse valget med 10 ug / ml blasticidin. Efter udvælgelsen er afsluttet (ikke mere utransficerede celler dør) udvidelse af cellerne kan starte og cellerne er klar til forsøg. Kronisk selektion med blasticidin muligt at generere en stabil cellelinie overudtrykker GFP-DGN eller GFP-dgnFS fusionsproteiner, klar til at måle proteasom aktivitet. Denne procedure garanterer en meget høj transfektionseffektivitet uafhængigt af celletypen.
6. Måling ved flowcytometri
- Frø ud 1 x 10 5 celler (bærer enten GFP-DGN eller GFP-dgnFS) dagen før forsøget.
- Behandling af kontrolceller 3 timer før målingen med proteasominhibitor, fx 100 ug / ml LLNL.
- Vask to gange med PBS og høste cellerne under anvendelse af 0,5 ml trypsin. At standse trypsinering anvende 4,5 ml dyrkningsmedium og overfører cellerne til et 15 ml Falcon.
- Spin than celler ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer mediet, cellerne resuspenderes i PBS og centrifuger igen ved 300 x g i 5 minutter ved 37 ° C.
- Aspirer PBS, resuspenderes i 400 pi FACS buffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCI, 2,5 mM CaCl2, pH = 7,4) og overføre cellerne til FACS rør.
- Holde cellerne på is og måle prøverne ved flowcytometri. Cellerne bør ikke opbevares i mere end 30 min ved 4 ° C.
7. Repræsentative resultater
GFP-DGN fusionsprotein bærer en sekvens, som er rettet mod proteasomet og derfor er proteinet umiddelbart nedbrudte; den svarer til faldet i GFP-fluorescens-signal. The rammeskift mutante (GFP-dgnFS) bærer en muteret version af denne sekvens og ikke nedbrydes af proteasomet, den fører til højere grøn fluorescens. Af disse grunde transduceret unge HDFS med forventet høj proteasom aktivitet og med GFP-dgn viser en lav (6% positive celler) fluorescenssignal i både flowcytometri måling og i epifluorescens (figur 2A og B, figur 3). Den samme HDFS transduceret med GFP-dgnFS viser 39,7% af positive celler. Behandlingen af cellerne med proteasominhibitor LLNL (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) rejste signal til maksimum på 62,9% i begge GFP-DGN og GFP-dgnFS celler (figur 2A og B ).
For at bestemme eventuel nedgang i proteasom aktivitet hos ældre mennesker hudprøver blev dermale fibroblaster isoleret fra unge, midaldrende og gamle donorer inficeret med GFP-DGN og GFP-dgnFS, som beskrevet ovenfor og dyrket til samme passage nummer før analyse ved flow cytometri. I disse eksperimenter donorer en klar stigning i GFP-signalet mellem unge individer (11,2 ± 0,88% GFP-positive celler) og midaldrende (20,4 ± 2,27% GFP-positive celler, p = 0,003) er blevet observeret, hvilket indikerer en fald i ProteasOMe aktivitet i prøver opnået fra ældede donorer 7 (figur 4). Ingen yderligere fald i proteasom aktivitet blev observeret i fibroblaster isoleret fra ældste individer (figur 4). Fluorescensintensitet for GFP-dgnFS var i alle tilfælde ~ 90% (data ikke vist), hvilket indikerer en høj transfektionseffektivitet for de tre forskellige aldersgrupper.
Figur 1. GFP-DGN og GFP-dgnFS sekvens. Vist er den 3'-enden af GFP (grønt) det multiple kloningssite af pEGFP-CL1-vektoren (grå) og DGN / dgnFS sekvens (rød).
Figur 2. Flowcytometrianalyse af GFP-DGN og GFP-dgnFS humane diploide fibroblaster. A. Young humane forhudsfibroblaster (HFF-2) blev inficeret med lentivirale vektorer, der bærer et grønt fluorescerende protein (GFP)-DGN-gen eller et GFP-dgnFS (rammeskift)-konstruktionen, som vist og analyseret for GFP-fluorescens ved anvendelse af flowcytometri (FACS Canto II, Becton Dickinson). Hvor det er angivet, blev cellerne også behandlet i 3 timer med proteasominhibitor N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLNL). Inficerede celler blev anvendt som kontrol. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. B. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. Tallene afspejler mængden af GFP-positive celler. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Fluorescensmikroskopi analyse af GFP-DGN og GFP-dgnFS HFF-2-celler. Young HFF-2 blev behandlet som i figur 2. Ved 9 dage efter infektion blev celler visualized ved fluorescens-og fasekontrastmikroskopi.
Figur 4. Ændringer i proteasom aktivitet i human aldring af huden. De menneskelige forhudsfibroblaster fra ni forskellige donorer i de angivne aldersgrupper blev minimalt ekspanderet og inficeret med lentivirale konstruktioner koder for GFP-DGN. Ved 9 dage efter infektion blev cellerne analyseret ved flowcytometri. Data blev opnået på tre prøver pr aldersgruppe i dubletter (± SE).
Figur 5. Eksperimentelle fremgangsmåde. Custom-oligo nucleotider for DGN og dgnFS klones ind i pEGFP-C1 vektor og vira fremstilles for hver konstruktion ved hjælp HEK 293FT celler. Titeren af virus bestemmes. Celler transduceres med viruset og udvides. Efter den foretrukne behandling cellerne analyseresfor fluorescenssignalet ved flowcytometri.
Figur 6. Kort over Plenti GFP-DGN. Kortet over pLenti6/V5-DEST vektor omfattende GFP-DGN sekvens vises. Forkortelser: pCMV (CMV-promotor), GFP-DGN (sekvens af GFP-DGN), P SV40 (SV40 tidlig promotor), Em7 (Em7 promotor), blasticidin (blasticidin resistensgen), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR med deleteret U3 region), SV40 pA (SV40-polyadenyleringssignal), ampicillin (ampicillinresistensgen), pUC ori (pUC oprindelse), pRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR hybridpromotor), Ψ (HIV-1 Ψ pakningssignal ), RRE (HIV-1 Rev-responselement).
Figur 7. U2-OS titrering plade. U2-OS blev udsået på en 6-brønds plade og transfekteret med forskellige virus-koncentrationer (fortynding på 1/100 og 1/10, 1, 5 og 10 pi concentrated viral supernatant). En brønd blev anvendt som ikke-transficerede kontrol (NT). Efter 6-7 dage blev cellerne farvet med krystalviolet og lufttørret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første offentliggørelse ved hjælp af grønt fluorescerende protein (GFP) som en reporter substrat for ubiquitin-proteasom aktivitet blev offentliggjort i 2000 12. Siden da har GFP blive et fælles redskab til at visualisere cellulære aktiviteter, navnlig den ubiquitin-proteasom proces. At overvåge Ubiquitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen musemodel med et GFP-baseret reporter er blevet indført 13. Yderligere in vivo forskning etableret en anden transgen musemodel med en lignende degron-destabiliseres GFP reporter som anvendt i denne publikation 14.
Desværre GFP som en reporter har en ufuldkommenhed, som er blevet vist ved Dantuma et al. Og Bowman et al. 12,15. For det første kan destabiliseret GFP akkumulere uden inhibering af proteasomet af ukendte årsager. Som det ubiquitin-proteasom maskiner er et system, hvis funktionalitet er afhængig af flere trin, adisturbance forud for nedbrydningen kan føre til akkumulering af reporter substratet og resultere i falsk-positive virkninger 12.. For det andet GFP-baserede reporter-substrater er på grund af deres korte halveringstider følsom overfor ændringer i transkription og translation. Enhver ændring i GFP-fluorescens kan derfor være et resultat af nedsat eller øget syntese og oversættelse 15. Disse problemer er blevet behandlet i andre undersøgelser ved modifikationer af GFP som følger:
Proteasom-aktivitet viste sig at være nedsat i cellulær ældning og organismal ældning 7, 8, 9, 10. Inden for forskning i aldring, er fokus primært på fjernelse af oxiderede proteiner, hvor proteasomet spiller en central rolle, og der er ingen afgørende beviser for, at protein ubiquitylation forud nedbrydning i dette tilfælde 2. Tidligere arbejde har også vist, at anvendelse af GFP med et muteret uncleavable ubiquitindel er egnet til at studere den komplekse proces protein nedbrydning 16. Dette GFP-konstruktion giver mulighed for at overvåge proteasom aktivitet uden den potentielle indflydelse på sin aktivitet via forstyrrelser i ubiquitin maskiner.
I dette arbejde har vi brugt en degron-destabiliseret GFP-baseret reporter protein (GFP-DGN) at overvåge ubiquitin-proteasom aktivitet i levende humane diploide fibroblaster. At få et overblik over transfektionseffektivitet, funktionalitet og transkription / translation niveauer af GFP-DGN reporter, blev flere passende kontroller inkluderet. Vi brugte unge ubehandlede GFP-DGN transficerede fibroblaster at vise, at der er næsten ingen grøn fluorescens synlig og proteasom funktion påvirkes ikke. For at validere, at signalet vokser med inhibering af proteasomet, behandlede vi GFP-DGN transficerede fibroblaster med proteasominhibitor at se akkumuleringen af GPF efter inhibering. Som en tredje kontrol vi brugte GFP-dgnFS. Med denne konstruktion kan vi vise Overall transfektionseffektivitet, som kan være forskellige fra cellestamme til cellestamme og med alle tre kontrolelementer vi har et overblik over syntesehastigheden af konstruktionerne i cellen.
Fremgangsmåden præsenteres her sætter brugeren i stand til at måle let og hurtigt den ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler. En stabil overekspression af GFP reporter substratet kan opnås med forskellige teknikker 17. I denne publikation er transfektion af GFP-DGN cDNA i cellerne opnået ved lentiviral system, som tilvejebringer en stabil ekspression. Desuden er brugen af dette system muliggør høj transfektionseffektivitet uafhængigt af celletypen, celle metabolisk tilstand eller donor 7 år. Har vi med succes anvendt denne protokol til at indføre DNA til endotelcellerne, som andre metoder til transfektion mislykkedes 18. Alligevel tidligere eksperimenter viste, at celler, der er ekspanderet længere i kultur viser en lavere fluorescenssignal end frisk transficerede celler muligvis på grund af den længere selektionstryk.
The PEG-fældning anvendes til at forøge titeren af det transformerende enheder pr ml (TU / ml). Hvis gode titre er nået (over 5 x 10 5 TU / ml), kan PEG-fældning udelades. Et vigtigt skridt i løbet af PEG nedbør er at undgå kraftig suspendere eller pipettering som genererer luftbobler. Det kan inaktivere viruspartikler og betydeligt fald transfektionseffektivitet.
Når du bruger proteasominhibitorer a priori forsøg skal udføres. Slutkoncentrationen anvendes, og inkubationstid er celletype afhængige og skal bestemmes eksperimentelt. Tidligere observationer om HFF-2-celler viste, at 3 h inkubation med LLNL ikke bør overskrides på grund af 1) de toksiske virkninger af inhibitoren 2) for høj GFP signal, der kan nås, eller 3) bivirkninger af proteasomhæmning flere længere time perioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af: National Research Network on Aging (NFN S93) af den østrigske Science Foundation (FWF), Europa-Kommissionen integrerede projekter MiMAGE og PROTEOMAGE, Holland Genomics Initiative / Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NGI / NWO, 05.040.202 og 050 - 060-810 NCHA), EU-finansierede Network of Excellence Levetid (FP6 036.894), og Innovation Oriented Research Program på Genomics (SenterNovem, IGE01014 og IGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
