Summary
Метод мониторинга убиквитин-протеасомной активности в живых клетках описано. Degron-дестабилизированный GFP-(GFP-DGN) и стабильный GFP-dgnFS гибридного белка создаются и преобразованных в ячейку с помощью лентивирусов вектор экспрессии. Этот метод позволяет генерировать стабильный GFP-dgn/GFP-dgnFS выражения клеточная линия, в которой убиквитин-протеасомной активности может быть легко оценить, используя эпифлуоресцентной или проточной цитометрии.
Abstract
Протеасомы является основным внутриклеточным органелл, участвующих в протеолитической деградации ненормально, неправильно свернутых, повреждены или окисленных белков 1, 2. Поддержание активности протеасом был замешан во многих ключевых клеточных процессов, таких как стресс клетки ответ 3, регуляцию клеточного цикла и клеточной дифференцировки 4 или в ответ иммунной системы 5. Дисфункции убиквитин-протеасомной системы была связана с развитием опухолей и нейродегенеративных заболеваний, 4, 6. Кроме того, снижение активности протеасом был найден как функция клеточного старения и старения организмов 7, 8, 9, 10. Здесь мы представляем метод измерения убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с использованием GFP-DGN гибридного белка. Чтобы быть в состоянии контролировать убиквитин-протеасомной активности в живых первичных элементов, комплементарной ДНК строит кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP)-DGN гибридного белка (GFP-DGN, неустойчивые) и вариант проведения рамки мутации (GFP-dgnFS, стабильные 11), которые вставляются в лентивирусов векторов экспрессии. Мы предпочитаем этот метод по сравнению с традиционными методами трансфекции, потому что она гарантирует очень высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток или возраст донора. Разница между флуоресценцией отображается GFP-dgnFS (стабильный) белка и дестабилизировали белка (GFP-DGN) в отсутствие или в присутствии ингибитора протеасом может быть использован для оценки убиквитин-протеасомной активности в каждый конкретный штамм клеток. Эти различия можно контролировать с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или может быть измерена с помощью проточной цитометрии.
Protocol
1. Плазмида строительства
- Заказать специальный олиго-нуклеотидов кодировки для DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) и для dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) и перевязывать его в pEGFP-C1 вектора для получения слияния GFP с DGN / dgnFS (рис. 1).
- Усиление последовательности, кодирующей GFP-DGN и GFP-dgnFS методом ПЦР в соответствии с протоколом pENTR направленности Kit клонирования TOPO и продолжить pLenti6/V5 направленности TOPO Cloning Kit (рис. 6).
2. Вирус производства
- За день до трансфекции (День 1) семя, из НЕК 293FT клеток в колбах T75 так, что они будут 90-95% сливающийся в день трансфекции.
- В день трансфекции разбавлять 36 мкл липофектамина 2000 реагента в 1,5 мл DMEM без сыворотки и антибиотиков в 15 мл сокола. Используйте другой 15 мл сокола и развести 3 мкг pLenti6/V5 проведения комплементарной ДНК построить для любой GFP -DGN или GFP-dgnFS, 2,5 мкг конверт кодирования плазмиды pMD2.G и 7,5 мкг вектора основу psPAX2 в 1,5 мл DMEM без сыворотки и антибиотиков. Через 5 мин разбавленный ДНК в сочетании с разбавленным липофектамина 2000 реагента.
- Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы ДНК-липофектамина комплексов форме.
- Удалите среду НЕК 293FT клеток, заменить его тщательно 7 мл среды (без антибиотиков) и добавить ДНК-липофектамина смесь в колбу и рок вперед и назад для смешивания (день 2). Инкубируйте колбу в течение ночи при 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
- Изменение средней на следующий день (10 мл среды без антибиотиков; день 3).
- После 48 часов (день 5) сбор супернатанта, центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант фильтруют через 0,45 мкм фильтр PVDF.
Культура средний - DMEM (НЕК 293FT)
палатка "> DMEM10% FBS
0,1 ммоль MEM NEAA
6 мМ L-глутамина
1 мМ пирувата натрия MEM
1% Pen-Strep (опционально)
500 мкг / мл генетицина (опционально)
3. Вирус концентрации полиэтиленгликоля (PEG) осадков
- Добавить одном томе полиэтиленгликоля раствор (50 мМ полиэтиленгликоля, 41 мМ NaCl, автоклав, рН = 7,2; PEG) в четырех томах супернатант и инкубировать в течение 2 часов при температуре 4 ° C. Тщательно смешайте его каждые 20-30 мин обращением.
- Спином вниз при 1500 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Белые гранулы должны быть видны.
- Аспирируйте супернатант и снова центрифугируют при 1500 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Аспирируйте оставшийся раствор PEG.
- Ресуспендируют гранул в средней или фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью пипетки вверх и вниз и энергично вихрь в течение 20 до 30 секунд. В качестве ориентира использовать 500 мкл в течение одного T75 колбы и аликвоты ее до 100 мкл. Храните вирус при температуре -80 ° C.
- Семенной из 5 × 10 4 U2-OS клеток в каждую лунку 6-луночный планшет за день до трансфекции.
- В день трансфекции удаления культуральной среды и заменить его на 1 мл DMEM, содержащей 8 мкг / мл полибрен (hexadimethrine бромид). Развести концентрированный вирус супернатант 1:10 и 1:100 и добавить 1 мкл на одну лунку. Для более высоких концентрациях вируса использовать 1 мкл, 5 мкл и 10 мкл концентрированного супернатанта вирус для остальных скважин. Одна скважина остается в качестве положительного контроля.
- На следующий день заменить средой 2 мл DMEM.
- Начните с выбора на следующий день. Применить 10 мкг / мл бластицидин на каждой лунке. Заменить среде, содержащей антибиотик каждый второй день.
- Примерно через 6-7 дней после начала отбора untransduced клетки мертвы. Для окрашивания мыть клетки три раза PBS и покрывают клетки с кристаллическим фиолетовым (10 мг / л кристаллический фиолетовыйВ 20% этанола) и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Аспирата кристаллический фиолетовый (может быть повторно использован несколько раз) и промыть лунки дважды DDH 2 O и высушить тарелки.
- Подсчет колоний и умножить на 1.000 и соответствующие разбавления (рис. 7). Эта процедура позволяет рассчитать трансфекции единиц (ТУ) вируса / мл.
Культура средний - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6мм L-глютамин
1% Pen-Strep
5. Transduction человека диплоидных фибробластов (Эта процедура может быть использована для любого типа клеток).
- Семенной из 5 × 10 4 человека диплоидных фибробластов (HDFS) в 6-луночные планшеты за день до трансдукции.
- Используйте множественности заражения двух вместе с 8 мкг / мл полибрен как трансдукции усилителя в общей сложности один миллилитр.
- Изменение средней на следующий день.
- КогдаКлетки на 70-80% слияния начала отбор с 10 мкг / мл бластицидин. После того, как выбор сделан (не более нетрансфицированных клетки погибают) расширение клетки могут начать и клетки готовы к экспериментам. Хронический выделение бластицидин позволяет генерировать стабильные линии клеток гиперэкспрессией GFP-DGN или GFP-dgnFS слитые белки, готовые для измерения активности протеасом. Эта процедура гарантирует очень высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток.
6. Измерение с помощью проточной цитометрии
- Семенной из 1 × 10 5 клеток (балансовая или GFP-DGN или GFP-dgnFS) за день до начала эксперимента.
- Лечить контрольных клетках 3 часа до измерения с ингибитором протеасом, например, 100 мкг / мл LLNL.
- Мыть два раза с PBS и урожай клеток с использованием 0,5 мл трипсина. Чтобы остановить trypsinisation использовать 4,5 мл культуральной среде и передать клеток в 15 мл сокола.
- Спин тОн клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте среды, ресуспендирования клеток в PBS и спином вниз на 300 мкг в течение 5 мин при 37 ° C.
- Аспирируйте PBS, ресуспендируют в 400 мкл FACS буфера (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl 2, рН = 7,4) и передать клеток в трубах FACS.
- Держите клетки на льду и меры образцов методом проточной цитометрии. Клетки не должны храниться дольше, чем 30 минут при 4 ° C.
7. Представитель Результаты
GFP-DGN гибридный белок несет в себе последовательность, которая предназначена для протеасомы и, следовательно, белок сразу деградировали, что соответствует уменьшению сигнала флуоресценции GFP. Рамки мутант (GFP-dgnFS) несет мутировавшие версии этой последовательности и не разлагается под протеасомы, это приводит к более высокому зеленую флуоресценцию. По этим причинам, молодые HDFS с ожидаемой высокой активности протеасом и трансдуцированных GFP-DGп показывает низкий (6% позитивных клеток) флуоресцентного сигнала в обоих измерений проточной цитометрии и в эпифлуоресцентной (рис. 2A и B, рисунок 3). То же самое HDFS трансдуцированных GFP-dgnFS отображать 39,7% положительных клеток. Обработка клеток с ингибитором протеасом LLNL (N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-norleucinal) поднял сигнал максимума 62,9% в обоих, GFP-DGN и GFP-dgnFS клеток (рис. 2A и B ).
Для определения возможного снижения активности протеасом в возрасте образцов человеческой кожи, кожных фибробластов изолированы от молодых, среднего возраста и старых доноров были инфицированы GFP-DGN и GFP-dgnFS, как описано выше и культивируется на тот же номер проход перед анализом методом проточной цитометрии. В этих опытах, четко увеличение GFP сигнала между молодых людей (11,2 ± 0,88% GFP-положительных клеток) и среднего возраста доноров (20,4 ± 2,27% GFP-положительных клеток, P = 0,003) наблюдается, что свидетельствует о снижение протеиOme активности в образцах, полученных от доноров в возрасте 7 (рис. 4). Нет дальнейшее снижение активности протеасом наблюдается в фибробласты изолированы от старых особей (рис. 4). Интенсивность флуоресценции для GFP-dgnFS во всех случаях ~ 90% (данные не приводятся), что указывает на высокую эффективность трансфекции для трех различных возрастных групп.
Рисунок 1. GFP-DGN и GFP-dgnFS последовательности. Отображаемые 3'-конце GFP (зеленый) сайт множественного клонирования pEGFP-CL1 вектору (серый) и DGN / dgnFS последовательности (красный).
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа GFP-DGN и GFP-dgnFS человеческих диплоидных фибробластов. А. Молодые фибробласты крайней плоти человека (HFF-2) были инфицированы лентивирусов векторов, несущих зеленого флуоресцентного белка (GFP)-DGN гена или GFP-dgnFS (рамки) строится, как показано и проанализировано для флуоресцентного микроскопа с помощью проточной цитометрии (FACS Песнь II, Becton Dickinson). Там, где указано, клетки также рассматриваются в течение 3 часов с ингибитором протеасом N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-norleucinal (LLNL). Неинфицированных клеток были использованы в качестве контроля. Эксперименты проводили в трех повторах. B. Данные представителем трех независимых экспериментах. Цифры отражают количество GFP-положительных клеток. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Флуоресцентного анализа микроскопии GFP-DGN и GFP-dgnFS HFF-2 клеток. Молодые HFF-2 были рассматриваться как показано на рисунке 2. В 9 дней после заражения, клетки Visualized с помощью флуоресцентной микроскопии и фазового контраста.
Рисунок 4. Изменения в активности протеасом в человеческое старение кожи. Фибробласты крайней плоти человека из девяти разных доноров в указанных возрастных группах были минимально расширен и инфицированных лентивирусные конструкций кодирующий GFP-DGN. В 9 дней после инфицирования клетки были проанализированы методом проточной цитометрии. Данные были получены на трех образцах в возрастной группе в двух экземплярах (± SE).
Рисунок 5. Экспериментальный подход. Custom-олиго-нуклеотидов для DGN и dgnFS клонируют в pEGFP-C1 вектор и вирусов производится для каждой конструкции использовании НЕК 293FT клеток. Титр вируса определяется. Клетки преобразуют с вирусом и расширена. После благоприятствования клетки анализируютдля флуоресцентного сигнала с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 6. Карта Plenti GFP-DGN. Карту pLenti6/V5-DEST вектор в том числе GFP-DGN отображается последовательность. Сокращения: PCMV (CMV промотор), GFP-DGN (последовательность GFP-DGN), P SV40 (ранний промотор SV40), Em7 (Em7 промоутер), бластицидин (бластицидин ген устойчивости), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR с удалить U3 область), SV40 рА (SV40 сигнал полиаденилирования), ампициллин (Ампициллин ген устойчивости), PUC Ори (PUC происхождения), PRSV / 5'-ДКП (RSV / 5'-ДКП гибридный промотор), Ψ (ВИЧ-1 Ψ сигнал упаковки ), RRE (ВИЧ-1 Rev ответ элемент).
Рисунок 7. U2-OS titering пластины. U2-OS высевали на 6-луночный планшет и трансфицировали с различными концентрациями вируса (разведение 1/100 и 1/10, 1, 5 и 10 мкл сотрудничестваncentrated вирусного супернатанта). Одна скважина была использована в качестве нетрансфицированных управления (NT). После 6-7 дней, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и сушат на воздухе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первые публикации с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера субстрат для убиквитин-протеасомной деятельность была опубликована в 2000 12. С тех пор, GFP стал распространенным инструментом для визуализации клеточной активности, особенно убиквитин-протеасомной процесса. Для контроля убиквитин-протеасомной активности в естественных условиях трансгенных мышах с GFP-журналистом, была введена 13. Дополнительные исследования в естественных условиях установлено другое трансгенных мышах с аналогичными degron-дестабилизированный GFP репортер, используемые в настоящей публикации 14.
К сожалению, GFP в качестве репортера имеет некоторые несовершенства, которое было показано Dantuma и соавт. Bowman и соавт. 12,15. Во-первых, дестабилизации GFP может накапливаться без ингибирования протеасомы по неизвестным причинам. Как убиквитин-протеасомной техника представляет собой систему, функциональные возможности которых зависит от нескольких шагов, объявлениеisturbance до деградации может привести к накоплению субстрата журналист и приводит к ложно-положительных эффектов 12. Во-вторых, GFP-подложки на основе репортер связаны с их коротким периодом полураспада чувствительны к изменениям в транскрипции и трансляции. Любое изменение флуоресценции GFP может быть поэтому в результате уменьшается или увеличивается синтез и перевод 15. Эти проблемы были решены в других исследованиях модификации GFP следующим образом:
Протеасома деятельности было установлено, что уменьшились в клеточное старение и организменном старения 7, 8, 9, 10. В области исследования старения, основное внимание в основном на удаление окисленных белков, где протеасома играет ключевую роль, и нет никаких убедительных доказательств того, что белок убиквитилированию предшествует деградация в этом случае 2. Предыдущие исследования также показали, что использование GFP с мутировал uncleavable убиквитин фрагмент подходит для изучения сложного процесса рrotein деградации 16. Это GFP-конструкция дает возможность контролировать протеасома деятельности без потенциального влияния на его деятельность через нарушения в убиквитин техники.
В этой работе мы использовали degron-дестабилизированный GFP-журналистом белка (GFP-DGN) для мониторинга убиквитин-протеасомной активности в живых человеческих диплоидных фибробластов. Чтобы иметь представление о эффективности трансфекции, функциональность и транскрипции / трансляции уровни GFP-DGN репортер, несколько надлежащего контроля были включены. Мы использовали молодые необработанной GFP-DGN трансфицированных фибробластов, чтобы показать, что нет почти никакого зеленого свечения видимого и протеасома функция не влияет. Чтобы подтвердить, что сигнал увеличивается с торможением протеасомы, мы относились к GFP-DGN трансфицированных фибробластов с ингибитором протеасом, чтобы увидеть накопления GPF после торможения. В качестве третьего управления мы использовали GFP-dgnFS. С помощью этой конструкции можно показать, OveraLL эффективности трансфекции, которые могут отличаться от клетки к клетке деформации напряжения и со всеми тремя управления мы имеем обзор за скорость синтеза конструкций внутри клетки.
Метод, представленный здесь, позволяет пользователю измерять легко и быстро убиквитин-протеасомной активности в живых клетках. Стабильной гиперэкспрессии подложки репортера GFP может быть достигнуто различными методами 17. В этой публикации, трансфекции GFP-DGN ДНК в клетки достигается за счет лентивирусные системы, которая обеспечивает стабильную выражение. Кроме того, использование этой системы обеспечивает высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток, состояние ячейки метаболических или донора 7 лет. Мы успешно использовали этот протокол для введения ДНК в эндотелиальных клетках, в которых другие методы трансфекции не удалось 18. Тем не менее, предыдущие опыты показали, что клетки, которые расширили больше в культуре отображения нижнего флуоресценциисигнала, чем недавно трансфицированные клетки возможно, связано с больше давления отбора.
Осадков PEG используется для увеличения титра преобразования единиц на мл (TU / мл). Если хорошие титры достигнут (выше 5 × 10 5 TU / мл), осадков PEG может быть опущен. Важный шаг в процессе PEG осадков, чтобы избежать энергичные приостановлении или пипеткой, которая генерирует пузырьки воздуха. Это может инактивировать вирус частиц и значительно снизить эффективность трансфекции.
При использовании ингибиторов протеасом априорно эксперименты должны быть выполнены. Конечная концентрация использоваться и времени инкубации являются клетки зависят от типа и должны быть определены экспериментально. Предыдущие замечания по HFF-2-клеток показало, что 3 часа инкубации с LLNL не должна быть превышена, потому что: 1) токсические эффекты ингибитора 2) слишком высокая GFP сигнал, который может быть достигнут, или 3) побочные эффекты протеасома торможения в течение длительного тимэлектронной периоды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано: Национальная сеть исследований по проблемам старения (NFN S93) по австрийским научного фонда (БПС), Европейская комиссия Интегрированные проекты MiMAGE и PROTEOMAGE, Нидерланды Genomics Инициатива / Нидерландская организация по научным исследованиям (NGI / NWO; 05040202 и 050 - 060-810 NCHA), финансируемого ЕС Сети мастерства продолжительность жизни (FP6 036 894), инновациям и ориентированных программ исследований геномики (SenterNovem; IGE01014 и IGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
