Summary
نحن تصف طريقة متعددة للكشف عن الكائنات الدقيقة ضمن عينة باستخدام الخرز ، بالإضافة الفلورسنت قليل النوكليوتيد. غير المهجنة Amplicon من جميع الكائنات الحية داخل عينة على لجنة التحقيق ، إلى جانب الخرز. وتستخدم أداة أو Luminex بيو الصفيف إلى الاستعلام كل حبة حبة لنوع وإشارة التهجين.
Abstract
التهاب المهبل الجرثومي (BV) هو متلازمة متعدد المكروبات المتكررة التي يتميز تغيير في مجهريات البقعة "طبيعية" من يهيمن عليها الملبنة لمجهريات البقعة التي تهيمن عليها لعدد من أنواع البكتيريا ، بما في ذلك الغاردنريلة المهبلية ، Atopobium المهبل ، و 1-3 الآخرين. ويرتبط هذا الشرط مع مجموعة من نتائج سلبية على الصحة ، بما في ذلك اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية 4 ، وأنه يمكن أن يكون من الصعب على إدارة سريريا 5. وعلاوة على ذلك ، اعتمد تشخيص BV على استخدام بقع غرام من المسحات المهبلية المسحة التي سجلت على معايير مختلفة 6،7 العددية. في حين أن هذا التشخيص غير بسيطة وغير مكلفة ، ويناسب المناطق ذات الموارد المحدودة ، ويمكن ان تعاني من مشاكل تتعلق التفسيرات الذاتية وأنها لا تعطي صورة تفصيلية للتكوين المهبل مجهريات البقعة 8. وقد كشفت مؤخرا جهود التسلسل عميقة ومتنوعة غنية مجهريات البقعة مع المهبليةواضح الخلافات بين عينات أخذت من الأفراد الذين يتم تشخيصهم مقارنة مع BV لأولئك الأفراد الذين يعتبرون 9،10 العادية ، مما أدى إلى تحديد عدد من الاهداف المحتملة للتشخيص الجزيئي لBV 11،12. وقد وفرت هذه الدراسات وجود ثروة من المعلومات المفيدة ، ولكن تسلسل عميق ليس بعد العملية كوسيلة تشخيصية في عملية إعداد سريرية. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة وسيلة لتنميط بسرعة مجهريات البقعة المهبل في شكل متعدد باستخدام قليل النوكليوتيد ، إلى جانب الخرز الفلورسنت مع الكشف على منصة Luminex 13. هذا الأسلوب ، مثل الطرق الحالية وصمة عار على أساس غرام ، هو سريعة وبسيطة ولكنها تضيف ميزة إضافية لاستغلال المعرفة الجزيئية الناجمة عن التسلسل الدراسات في تصميم المسبار. هذا الأسلوب يوفر بالتالي وسيلة لملف كبير الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في المسحة المهبلية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص BV مع خصوصية عالية الحساسية وشركاتحمراء مكتوب لصبغة جرام بينما توفر معلومات إضافية حول وجود وفرة الأنواع وبطريقة شبه الكمي والسريع. هذا الأسلوب متعددة قابلة للتوسع إلى ما وراء نطاق المقايسات الحالية PCR الكمي للكائنات معينة ، والتي تقتصر حاليا على 5 أو 6 فحوصات مختلفة في عينة واحدة 14. الأهم من ذلك ، لا يقتصر على أسلوب للكشف عن البكتيريا في مسحات مهبلية ويمكن تكييفها بسهولة للملف بسرعة أي ما يقرب من المجتمع الميكروبي من الفائدة. على سبيل المثال ، بدأنا مؤخرا في تطبيق هذه المنهجية في تطوير أدوات تشخيصية للاستخدام في محطات معالجة مياه الصرف الصحي.
Protocol
وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في Dumonceaux وآخرون. J. كلين. . Microbiol 47 ، 4067-4077 ، دوى : 10.1128/jcm.00112-09 (2009).
يتم تقديم رسم تخطيطي يصور الداخلي الإجمالي في الشكل 1.
1. حبة اقتران
هذا يصف الطرق التي ستستخدم لاقتران قليل النوكليوتيد تحقيقات لحبات Luminex البوليسترين (انظر الجدول 2). يتم تكييفها وحدات التخزين قليلا لتقييم تحقيقات التقاط جديد على أساس تجريبي ، وترد هذه الكميات بين قوسين.
- إزالة - 1 - 3 - الأثيل (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide حمض الهيدروكلوريك (EDC) من مسحوق dessicator -20 درجة مئوية ودافئة لدرجة حرارة الغرفة.
- Resuspend والمجهرية التي sonciation في sonicator بالحمام المائي لمدة 20 ثانية ، ثم vortexing حوالي 20 ثانية.
- نقل 400 ميكروليتر (100 ميكرولتر) من المجهرية إلى أنبوب إيبندورف (وهذا يتوافق مع 5x10 6 أو 1.25x10 6 المجهرية). Luminex تقترح استخدام أنابيب البروتين microcentrifuge ملزمة منخفضة (مثل أنابيب إيبندورف LoBind البروتين ، ورقم 0030 الكتالوج 108.094) لمنع uncoupled حبات من الالتصاق للأنابيب والتدخل في الانتعاش حبة. لم نجد هذا وجود مشكلة في استخدام معيار أنابيب البولي بروبلين microcentrifuge ، والتي نستخدمها عادة (مثل رقم الكتالوج VWR 87003-298).
- بيليه في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة وتجاهل طاف.
- Resuspend والمجهرية في 50 ميكروليتر (12.5 ميكرولتر) من درجة حرارة الغرفة 0.1 م 2 -- (N - Morpholino) ethanesulfonic حمض (MES) الرقم الهيدروجيني 4.5.
- اعداد جديدة من حل EDC في 10 ملغ / مل في الماء.
- تعد أقل من 1 مل من هذا الحل عن طريق وزن 50-10 ملغ من EDC على نطاق التحليل ، ثم إضافة الماء إلى 10 ملغ / مل.
- إضافة 1 nmol من 5' - الأمينية قليل النوكليوتيد التقاط C12 - تعديل الجدول (2) إلى مزيج المجهرية والتي vortexing. 1 nmol هو 5 ميكرولتر من 200 ميكرومتر بنسبة ضئيلةالنوكليوتيدات.
- إضافة 2.5 ميكروليتر من محلول EDC جديدة لالمجهرية ومزيج من قبل vortexing لمدة 5 ثوان.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- تجاهل حل EDC (الخطوة 1.6) ، وإعداد عينة جديدة من EDC ملغ / 10 مل في الماء على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.6).
- إضافة آخر ميكرولتر 2.5 من الحل EDC جديدة لالمجهرية ودوامة لمدة 5 ثوان.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- تغسل حبات بإضافة 1 مل من 0.02 ٪ توين 20. الدوامة (يصوتن اختياريا لمدة 20 ثانية أيضا) لresuspend الخرز.
- الطرد المركزي 14000 XG 1 دقيقة. إزالة وتجاهل طاف.
- تغسل حبات مرة أخرى عن طريق إضافة 1 مل من كبريتات الصوديوم 0.1 ٪ دوديسيل (SDS). الدوامة (يصوتن اختياريا لمدة 20 ثانية أيضا) لresuspend الخرز.
- الطرد المركزي 14000 XG 1 دقيقة. إزالة وتجاهل طاف.
- Resuspend الخرز في 100 ميكروليتر (25 ميكرولتر) من تريس - EDTA (TE) العازلة [10 مM - CL تريس درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0].
- تعداد الخرز في عداد كولتر haemocytometer أو لتحديد تركيز الأسهم.
- إعداد مزيج ماجستير Microsphere بواسطة تمييع كل حبة إلى تركيز النهائي من 100 الخرز / ميكروليتر في TE العازلة. تجمع حبات جانب المقابلة لنوع plex المرجوة من الفحص (على سبيل المثال لفحص نوع plex 10 ، 10 مزيج مختلف الخرز يقترن بتركيز نهائي 100/μl كل حبة).
- تخزين ميكس Microsphere ماجستير في 4 في الظلام درجة مئوية. ويمكن تخزين الخليط لمدة أشهر إذا كان يحتفظ بها في ظل هذه الظروف.
2. Chaperonin 60 هدفا عالميا (cpn60 UT) amplicon الإنتاج وتوليد خيوط واحدة.
- بوليميريز توليد التفاعل المتسلسل (PCR) المنتج لكل عينة. وتشمل مجموعة phosphorothioate والبيوتين المعدلة 5 'التمهيدي (الجدول 1). انظر الجدول رقم 3 وحدات التخزين لمزج وتركيز.
- مباشرة بعد اكتمال PCR ، إضافة 2 ميكروليتر (20 وحدة) السابقين T7onuclease لكل أنبوب PCR (PCR المخزن المؤقت سيكون كافيا للتفاعل T7). احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة (~ 22-25 درجة مئوية) لمدة 40 دقيقة.
- في نهاية هذه الحضانة ، إضافة 12.5 ميكرولتر من الإيثيلين ديامين M 0،5 حمض tetraacetic (EDTA) ودرجة الحموضة 8.0 المزيج. هذا يعطي ما مجموعه ~ 64.5μl من الناتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل.
3. التهجين من الناتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل على الخرز البوليسترين ، بالإضافة قليل النوكليوتيد.
- Prewarm الصك إلى 60 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة خلال التهجين التحليل. بدوره على سخان منصة باستخدام البرمجيات الصك والتأكد من استخدام التدفئة كتلة النحاس الذي يناسب لوحة PCR الطراز الذي يحتوي على مزيج حبة المهجنة.
- Resuspend ميكس ماستر Microsphere (الخطوة 1.20) مع ماصة ، الاستغناء مبلغ مناسب في أنبوب إيبندورف ، وكأب الأنبوب ، ويصوتن في sonicator بالحمام المائي لمدة 2 دقيقة. بدلا من ذلك ، لضمان الاتساق المطلق في resuspe حبةnsion ، يمكن معلق المزيج بواسطة سيد microsphere vortexing وpipetting ، ثم صوتنة على النحو الوارد أعلاه ، ثم الاستغناء عن المبلغ المطلوب في أنبوب إيبندورف البولي بروبلين.
- الاستغناء عن 17 ميكرولتر من الناتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل (الخطوة 2.2) في الآبار الملائمة لالانظار - 96 - PCR Thermowell كذلك لوحة (الجدول 2). إضافة 33 ميكرولتر من خليط sonciated معلق ، وحبة على كل جانب. مع تغطية غطاء سيليكون (الجدول 2) والاستفادة بلطف.
- وضع لوحة في thermocycler مع برنامج : 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، و 60 درجة مئوية عقد ، و 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، الغاية. بدء تشغيل البرنامج.
- جعل الطازجة streptavidin - فيكوإيريترين (SA - PE) حل ، وسوف تحتاج 25 ميكروليتر لكل بئر (جعل العديد من الآبار الاضافي). جعل SA - PE حل عن طريق تمييع الأسهم SA - PE (1 ملغ / مل) 01:50 إلى 20 ميكروغرام / مل مع رباعي ميثيل الأمونيوم كلوريد 1X (TMAC) العازلة (3 M TMAC ؛ 0.1 ٪ Sarkosyl و 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ؛ 4 مم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0).
- عندما thermocycler يحصل على 60 درجة مئوية خطوة عقد ،فتح الغطاء ، وإزالة غطاء سيليكون وإضافة SA - PE حل مباشرة إلى كل بئر (لا تأخذ لوحة من أصل thermocycler). استبدال غطاء سيليكون ، وإغلاق غطاء thermocycler واستئناف البرنامج.
- عند اكتمال البرنامج ، واتخاذ لوحة من أصل ونقل بسرعة إلى الجهاز BioPlex للقراءة. يجب أن تقرأ لوحة في غضون 10 دقيقة. قراءة عند 60 درجة مئوية ، وضمان أنه قد تم في prewarmed BioPlex إلى هذه الدرجة. أن تكون على يقين أنه تم ضبط ارتفاع المسبار لاستيعاب استخدام لوحة ، كما هو موضح في دليل المستخدم لأداة المستخدمة.
- حبة لدقيقة والكشف عن إشارة ، لا بد من تعيين إعدادات بوابة على BioPlex وفقا لنوع المجهرية المستخدمة. الخرز البوليسترين BioRad تتطلب إعدادا بوابة 4،335-10،000 المغناطيسي المجهرية في حين يتطلب وضع 5،000-25،000. هناك أيضا خيار تشغيل لوحة باستخدام الإعداد PMT السامي الذي يزيد من قيمة مكاسب المراسل. وهذا يمكن أن طncrease كثافة أقل الاشارات لكن من المهم تشمل المراقبة المناسبة سلبية كما سيتم أيضا إشارة الخلفية يمكن زيادة.
4. ممثل النتائج :
كان واحدا من أهدافنا في تطوير وتنفيذ هذا الاختبار لجعلها بسيطة ومبسطة قدر الإمكان. لذا فإننا الأمثل الحرجة بعد التضخيم الخطوات ، بما في ذلك نوكلياز خارجية T7 وقت المعالجة والوقت التهجين من أجل وضع مقايسة التي يمكن الانتهاء منها في فترة زمنية معقولة. كما هو مبين في الشكل 2A ، T7 معاملة amplicon أمر ضروري لتوليد الإشارات ، لأن معظم التحقيقات كانت إشارة ضئيلة أو معدومة مع العلاج T7 قصيرة أو معدومة. زيادة إشارة خطيا حتى ما يقرب من 40 دقيقة ، في الوقت الذي تباطأت الزيادة إشارة. لم يلاحظ أي تدهور للإشارة حتى في 2 ساعة من الوقت T7 العلاج ، مشيرا الى ان التعديل phosphorothioate من الاشعال فعالة للغاية في منع targeر تدهور حبلا كما هو موضح 15. اخترنا 40 دقيقة للمرة T7 العلاج لتقليل الوقت بروتوكول عموما ، لكنه هو واضح من الشكل 2A T7 أن العلاج يمكن أن يستمر لفترة أطول من ذلك بكثير. ونحن مصممون أيضا تأثير الزمن على توليد إشارة التهجين (الشكل 2B) ووجدت أن 10 دقيقة كانت كافية للإشارة الحد الأقصى ، حيث لا يوجد زيادة في إشارة لوحظ حتى بعد 4 ساعات من التهجين. ولذلك ، تم اختيار خطوة التهجين الدقيقة 10 ، ومرة أخرى لتقليل الوقت الفحص الشامل. مع هذه النتائج في الاعتبار ، والسريع مع تقنيات استخراج الحمض النووي مثل InstaGene (بيو راد) ، ويمكن الانتهاء من الفحص الشامل بما في ذلك استخراج الحمض النووي ، PCR ، وتحليل Luminex في ساعات 4-5.
على سبيل التحذير ، لا يمكن للمستوى التجميع من الخرز البوليسترين خلال تشغيل Luminex BioPlex أو يكون لها تأثير كبير على كفاءة الفحص. يقوم البرنامج BioPlex عرض مستوى التجميع حبة ، والذي يحدث عندماتم الكشف عن أكثر من حبة في مسار الليزر والنتائج في استبعاد الإشارة التهجين من مجموع المباراتين. ويمكن أيضا تجميع حبة الواضح أن يسببه أي الجسيمات التي ليست مناسبة لحجم حبة واحدة ، وحتى يمكن أن يكون سبب فقاعات الهواء. في أي من هذه الأحداث ، يتم تجاهل الإشارة من إجمالي حبة ، فقاعة هواء ، أو الجسيمات. في معظم الحالات ، نجد أن التجميع حبة هو الحد الأدنى (الشكل 3A) ، والمستوى المستهدف من 100 حدث العد لكل حبة يمكن تحقيقه بسهولة. في بعض الأحيان ، ولكن ، الخرز تظهر المعتدلة (الشكل 3B) أو الشديدة (الشكل 3C) مستوى التجميع. في هذه الحالات ، حيث يتم تجاهل معظم البيانات ، قد تجد صعوبة في الوصول صك 100 حبة لكل نوع الأحداث والنتائج التي قد تكون موضع تساؤل. المقصود صوتنة الخطوة (الخطوة 3.2) للحد من تكدس حبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تخزين حبات بأنها مزيج microsphere الرئيسي تمييع (الخطوة 1.20) مساعدة. لاحظنا أن تستبعد من TMAC hybriالعازلة dization -- إضافته إلى مخفف SA - PE بدلا من ذلك (3.5 خطوة) -- يساعد على تقليل التجميع حبة. وعلاوة على ذلك ، في حين أننا لم نجرب ذلك ، يعتقد أن أجدد حبات مغناطيسية أو المتاحة من Luminex BioRad لعرض أقل من ميل إلى تجميع.
نتائج تطبيق مجموعة Luminex 5 - نوع plex استهداف G. المهبلية ، A. المهبل ، L. iners ، L. crispatus ، ولام وتظهر جنبا إلى جنب مع gasseri غرام الملطخة المسحة المهبلية مسحات المناظرة في الشكل 4. وقد أخذت هذه العينات من فرد واحد في نقطة زمنية متعددة. في وقت 0 ، تم تشخيص الفرد مع BV على أساس غرام وصمة عار (الشكل 4A) ونتائج هذه العينة من Luminex نفس الشكل (4B) تبين أن الكائنات الحية الممثلة في مجموعة ، G. وكان المهبلية الأكثر انتشارا ، في حين أ الأغماد ولام وكانت iners ايجابية ايضا. بعد تسعة أيام ، وكان الفرد لا تزال ايجابية وBV قignal لG. وكان المهبلية زيادة كبيرة في حين أ الأغماد ولام وكانت iners تزال إيجابية. الأهم من ذلك ، بعد هذا الوقت بدأ الفرد في الانتقال إلى مجهريات البقعة كالمعتاد عصيات إيجابية الجرام أصبح كشف في لطخات (الشكل 4A) في حين أن الإشارة للG. وتضاءلت المهبلية إشارة للام زيادة iners (الشكل 4B). بواسطة تعريفنا الأصلي BV مع هذا الأسلوب (عينات إيجابية للالمهبلية G. و / أو ألف المهبل اعتبرت ايجابية BV) 13 ، وكان هذا الشخص BV إيجابية في جميع نقاط الوقت ، على الرغم من أن غرام وصمة عار للكشف عن فشل G. المهبلية في النقاط الأخيرة زمنيتين. مع أسلوب Luminex الموصوفة هنا ، يمكن بسهولة مقارنة الاتجاهات لتسلسل المستندة إلى أساليب ونتائج الفحص Luminex تثبت البقع عادة 13 جرام بينما توفر معلومات إضافية عن هوية الكائن الحي والوفرة.
الشكل 1. رسم تخطيطي للبروتوكول Luminex لتحديد الشخصية مجهريات البقعة من عينة سريرية معقدة أو بيئية. بروتوكول يبدأ الحمض النووي القالب الذي تم استخراجه من عينة من الفائدة. (1) انتج منتج PCR من الحمض النووي باستخدام قالب حبلا محددة biotinylated ، phosphorothioate المعدلة cpn60 UT الاشعال PCR مقرونا معدلة cpn60 الاشعال UT PCR (الجدول 1) ، (2) وهذا يولد بركة منتج PCR تمثل مجهريات البقعة مع البيوتين phosphorothioate تعديل على واحدة حبلا ، (3) ملخص للمنتج PCR المزدوج تقطعت بهم السبل مع نوكلياز خارجية T7 ، والتي لا تتحلل حبلا phosphorothioate المعدلة ويولد ذلك المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي التي يتم تعديلها في النهاية 5 'مع البيوتين ، (4) زوجين الخرز البوليسترين لأنواع محددة تحقيقات UT cpn60 -- كل حبة له عنوان فريد الطيفية (المشار إليها بواسطة حبة اللون) الذي طق ملحوظ من قبل Luminex أو صك الحيوية الصفيف ، (5) هجن المنتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل ولدت من العينة التي تهم مجموعة من الخرز ، إلى جانب قليل النوكليوتيد أنواع محددة ؛ (6) إضافة streptavidin - فيكوإيريترين المتقارن التي تربط ل وbiotinylated منتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل والأفعال كمؤشر على التهجين ؛ (7) تحديد عنوان الطيفية (حبة الهوية) ، وتهجين شدة إشارة باستخدام Luminex أو صك الحيوية الصفيف. يتم حساب لا يقل عن 100 حبات حبة لكل هوية وذكرت ومتوسط كثافة مضان (MFI) للإشارة فيكوإيريترين والإخراج. ويمكن تقييم ما يصل الى 100 حبة أنواع مختلفة في نفس الوقت ولكن يتضح an مقايسة تظهر ثلاثة أنواع من التمييز حبة. (8) عندما يعيد إنشاء مؤسسات التمويل الأصغر من PCR من نفس العينة هو أكبر بكثير من السيطرة السلبية للحبة معين (وحيد الطرف الطالب اختبار t ، P <0.05) ، وتعتبر عينة لتكون ايجابية لهذا الكائن الحي.
الشكل 2. التحسين من المعلمات مقايسة Luminex. واستخدمت خمسة تحقيقات مختلفة تستهدف الهضمونية العقدية اللاهوائية مع amplicons المتولدة من قالب مختلطة تضم البلازميدات تحتوي على استنساخ cpn60 UT من 20 البكتيريا المعروفة لتكون مرتبطة مع المهبل ، بما في ذلك P. اللاهوائية. (A). تأثير نوكلياز خارجية T7 وقت العلاج. وأعقب البروتوكول المذكورة أعلاه ولكن تباينت الوقت في المعاملة مع نوكلياز خارجية T7 قبل التهجين ومتوسط كثافة مضان (MFI) كان مصمما لجميع التحقيقات. (B). تأثير الوقت التهجين. وأعقب البروتوكول المذكورة أعلاه مع مجموعة متنوعة من الأوقات التهجين. واستخدمت مجموعات من نفس تحقيقات مع amplicon إنشاؤها من القالب نفسه كما في ألف وتم تحديد متوسط كثافة مضان (MFI) لكافة التحقيقات.
الشكل 3. تحديد التجميع حبة BioPlex باستخدام البرمجيات. يتم إعطاء ثلاثة أمثلة من يدير BioPlex فيها مستوى التجميع حبة هو (أ) مقبول (5 ٪) ، (B) الحدودي (50 ٪) ، وغير مقبول (C) (80 ٪).
الشكل 4. تطبيق مجموعة Luminex 5 إلى تشخيص نوع plex BV في عينات أخذت من متتابعة للفرد نفسه. (A). غرام الملطخة عرض الشرائح التشخيص التقليدية المستخدمة لتقييم كل عينة لبي. (B). تطبيق مجموعة Luminex 5 - نوع plex أعدت ونفذت كما هو موضح في هذا البروتوكول الى العينات الأربع ذاتها المبينة في الفقرة (أ). والبكتيرية التي تستهدف مؤسسات التمويل الأصغر إشارة إيجابية بشكل ملحوظ تعريفنا يشار إلى (واحد الذيل الطالب اختبار t ، P <0.05) من قبل النجمة (*).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خصوصية توليد إشارة ذات أهمية حاسمة ، يجب أن تكون على ثقة من أن لاحظ إشارة تعكس حقا كشف amplicon المتولدة من ذلك الحي. يمكن لبرامج مثل PrimerPlex (الدوري Biosoft) على تصميم التحقيقات التي من شأنها أن يهجن بكفاءة ، لكنها قد تكون أو لا إلى الأنواع غير المستهدفة عبر هجن. عندما تستخدم بادئات PCR عالمية كما هو موضح في هذا البروتوكول ، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن إنشاء amplicon يمثل جميع الكائنات الحية الموجودة في العينة. من المهم ، لذلك ، لتحليل التحقيقات المحتملة لإمكانية التهجين المتبادل بمقارنة تسلسل الذي اقترحه التحقيق تصميم البرمجيات لcpnDB ، وقاعدة بيانات تسلسل UT cpn60 16 ؛ تحقيقات التي تطابق الكائنات متعددة هي التي ينبغي تجنبها إذا كان ذلك ممكنا . علاوة على ذلك ، عندما يتم تحديد تحقيقات محددة محتملة ، اتخذنا نهجا للتحقيق في التحقق من صحة التي معقدة والشركة المصرية للاتصالات الاصطناعيمستعدة mplate المقابلة لUT cpn60 المستنسخة لعدد من الكائنات الحية المرتبطة مجهريات البقعة من الفائدة 13. ثم يتم إنشاء Amplicon من "لوحة مختلطة" كاملة ، بما في ذلك القالب المستهدفة ، وتتم مقارنة إشارة إلى أن ولدت من قالب second تتألف من لوحة المختلطة التي لا تحتوي على الكائنات المستهدفة cpn60 UT. ويتم اختيار تحقيقات التي تولد عالية إشارة إلى نسبة الضوضاء (حيث يتم إنشاء إشارة من لوحة كاملة ويتم توليد الضجيج من لوحة من دون قالب الهدف) لإدراجها في الفحص النهائي. لقد قمنا بتحليل عادة 4-5 تحقيقات المحتملة لكل كائن الهدف قبل اختيار واحد لإدراجها في مجموعة Luminex النهائي.
تعريف نتيجة إيجابية هي المسألة التي يجب النظر فيها. لقد وجدنا أن تحقيقات مختلفة ومختلفة بطبيعتها إشارة إلى الضوضاء نسب ، لذلك قررنا على النهج الذي هو نتيجة ايجابية definبقلم اختبار إحصائي بسيط جدا : الطالب اختبار t (واحد من الذيل). ويعرف نتيجة ايجابية من خلال مقارنة مؤسسات التمويل الأصغر من العينة إلى عنصر التحكم "لا قالب" ، وعندما الأصغر هو أعلى بكثير من التحكم في ع <0.05 ، يعتبر نتيجة ايجابية لتكون لهذا الحي. عادة بين شهرين ولدت amplicons مستقل يتم اختبارها في كل مكررة. على الرغم من أن PCR والخطوات نوكلياز خارجية T7 خلق حوالي 64.5 ميكرولتر من الناتج PCR واحد الذين تقطعت بهم السبل (الخطوة 2.3) ، ويستخدم فقط 17 ميكروليتر من هذا التهجين ل(الخطوة 3.2) ، مما يكفي لفحوصات التهجين 3 ، ونحن نحلل عادة مكررة من اثنين من التكبير إلى تعطي تكرار المتأصلة التقنية بدون استخدام عدد كبير من الآبار.
أحد جوانب هذا الاختبار أن لدينا هو التحقيق في شبه الكمي الطبيعة. إشارة الأصغر من التحقيق نظرا ليرتبط بشكل جيد وفرة qPCR التي تحددها لكائن معين (معامل الارتباط سبيرمان رتبة & Rحو ؛ = 0.4686 ، P <0.0001) 13 ، ولكن في نطاق محدود هو دينامية ، ويميل إلى إشارة تشبع في مستويات أعلى الكائن المستهدف ، كما هو متوقع لأن تحليل amplicon بعد نقطة النهاية PCR من 40 دورة. لأنه شبه الكمي ، يمكن رصد الاتجاهات في وفرة الكائنات الحية والأنماط الملاحظة (حفظ التحذير في الاعتبار فيما يتعلق إشارة تشبع في تركيزات أعلى). على سبيل المثال ، ويبين الشكل 4 لمحة عن مجهريات البقعة المهبلية الفرد على مر الزمن لأنه يغير من BV إلى وضعها الطبيعي. كما يحدث هذا ، إشارة إلى المقابلة G. المهبلية (كائن BV المرتبطة 17) الزيادات ثم يتراجع ، في حين على مدار الساعة لرصد إشارة ل. iners الزيادات. بقع غرام المقابلة ، والتيار "معيار الذهب" لتشخيص BV ، حيث تبين وجود نمط عصيات إيجابية الجرام غائبة في البداية ولكن يتم كشفها في نقاط وقت لاحق. الأسلوب Luminex كلا يحدد الكائنات الموجودة في العينة ، ويعطي لياليلى بعد معلومات عن تركيزات النسبية. ويمكن استخدام هذا النوع من المعلومات يمكن استخدامها لمراقبة عينات من أي نوع لاتجاهات غير مرغوب فيها وفرة من الكائنات الحية خاصة ويمكن أن توفر هذه البيانات بالنسبة لعدد كبير من الكائنات الحية في وقت واحد.
الأهم من ذلك ، لا يقتصر هذا الأسلوب لتحديد سمات مجهريات البقعة المهبل ، ويمكن منطقيا أن تنطبق على أي البيئة التي الكمي والجزئي للكشف عن مجموعة من الكائنات الهدف هو مرغوب فيه. عند تطبيق الأسلوب لبيئات أخرى ، فمن المهم للنظر في إمكانية حدوث تثبيط PCR ، ومثبطات PCR عادة التعاون مع تنقية الحمض النووي من العديد من البيئات 18. حيث PCR تثبيط قضية ، ويمكن لنموذج أن تضعف أو المنقى أخرى من أجل توليد ما يكفي من الإشارات لهذا الاختبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر البرتو Severini وGoleski فانيسا للمساعدة في تطوير فحص والتعليقات الهامة على هذا المخطوط. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وكالة الصحة العامة في كندا لتقديم المساعدة وبرنامج البحوث الصناعية (المجلس القومي للبحوث في كندا). تم الحصول على دعم إضافي من جامعة ساسكاتشوان الصندوق النشر.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
