Multiplex Påvisning af Bakterier i komplekse kliniske og miljøprøver hjælp Oligonucleotid koblede Fluorescent Mikrokugler

Summary

Vi beskriver en multiplex metode til påvisning af mikroorganismer i en prøve ved hjælp oligonukleotid-koblede fluorescerende perler. Amplikon fra alle organismer i en prøve er hybridiseret til et panel af sonde-koblede perler. En Luminex eller Bio-Plex instrument bruges til at forespørge hver perle for perle type og hybridisering signal.

Abstract

Bakteriel vaginose (BV) er en tilbagevendende polymikrobiale syndrom, der er karakteriseret ved en ændring i den "normale" mikrobiota fra Lactobacillus-domineret til en mikrobiota domineret af en række bakteriearter, herunder Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, og andre ^1-3. Denne betingelse er forbundet med en række negative sundhedsvirkninger, herunder hiv erhvervelse ^4, og det kan være svært at håndtere klinisk ^5. Endvidere har diagnosen BV har påberåbt sig brugen af Gram-farvning af vaginal podepind udstrygninger, der er scoret på forskellige numeriske kriterier ^6,7. Mens denne diagnose er enkel, billig og velegnet til ressource-begrænsede indstillinger, kan det lider af problemer relateret til subjektive fortolkninger, og det giver ikke en detaljeret profil af sammensætningen af vaginal mikrobiota ^8. Seneste dybe sekventering bestræbelser har afsløret en rig, varieret vaginal mikrobiota medklare forskelle mellem prøver taget fra enkeltpersoner, der er diagnosticeret med BV i forhold til de personer, der betragtes som normale ^9,10, hvilket har resulteret i identifikation af en række potentielle mål for molekylær diagnostik af BV ^11,12. Disse undersøgelser har givet et væld af nyttige oplysninger, men dybt sekvensering er endnu ikke praktisk som en diagnostisk metode i et klinisk miljø. Vi har for nylig beskrevet en metode til hurtigt at profilering af vaginal mikrobiota i en multiplex-format ved hjælp oligonucleotid-koblede lysstofrør perler med detektion på en Luminex platform ^13. Denne metode, som den nuværende Gram-farvning-baserede metoder, er hurtig og enkel, men tilføjer yderligere fordel af at udnytte molekylær viden, der hidrører fra sekventering studier i sonde design. Denne metode giver derfor en måde at profilere store mikroorganismer, som er til stede i en vaginal podepind, der kan bruges til at diagnosticere BV med høj specificitet og følsomhed compared til Gram-farvning samtidig give yderligere oplysninger om arternes tilstedeværelse og overflod i en semi-kvantitativ og hurtig måde. Denne multipleks Metoden kan udvides langt ud over den vifte af aktuelle kvantitativ PCR assays for bestemte organismer, som for øjeblikket er begrænset til 5 eller 6 forskellige analyser i en enkelt prøve ^14. Det er vigtigt, er metoden ikke begrænset til påvisning af bakterier i vaginal podninger og kan nemt tilpasses til hurtigt at profilen næsten enhver mikrobielle samfund af interesse. For eksempel har vi for nylig begyndt at anvende denne metode til udvikling af diagnostiske værktøjer til brug i renseanlæg.

Protocol

Denne metode blev brugt i forskning, aflagde rapport i Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Et diagram viser den overordnede procedure er vist i Figur 1.

1. Bead kobling

Her beskrives de metoder, der skal anvendes til kobling oligonukleotid sonder til polystyren Luminex perler (se tabel 2). Mængderne er tilpasset lidt for vurdering af nye fange sonder på forsøgsbasis, og disse mængder er angivet i parentes.

1. Fjern 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) pulver fra -20 ° C eksikkator og varm det til stuetemperatur.
2. Resuspendere mikrosfærerne ved sonciation i vandbad sonicator i 20 sekunder, så vortex cirka 20 sekunder.
3. Overfør 400 μl (100 μl) af mikrosfærer til et eppendorfrør (dette svarer til 5x10 ⁶ eller 1.25x10 ⁶ mikrosfærer). Luminex foreslår brug af lav proteinbinding mikrocentrifugerør (f.eks Eppendorf Protein LoBind rør, katalognummer 0030 108,094) for at forhindre koblet perler fra stikning til rør og blande sig med perle opsving. Vi har ikke fundet dette at være et problem ved hjælp af standard polypropylen mikrocentrifugerør, som vi typisk bruger (f.eks VWR katalognummer 87003-298).
4. Pellet på 14000 xg i 1 minut. Fjern og kassér supernatanten.
5. Resuspendere mikrosfærerne i 50 μl (12,5 μl) af rum-temperatur 0,1 m 2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 4,5.
6. Forbered en frisk opløsning af EDC på 10 mg / ml i vand.
   1. Forbered mindre end 1 ml af denne opløsning ved vejning 5-10 mg af EDC på et analytisk plan, så tilsætning af vand til 10 mg / ml.
7. Tilsæt 1 nmol af 5'-amino C12-modificeret capture oligonucleotid (Tabel 2) til mikrokugler og bland ved hvirvelblanding. 1 nmol er 5 mikroliter af 200 μM oligonukleotid.
8. Tilsæt 2,5 μl af frisk EDC løsning på mikrokugler og bland ved hvirvelblanding i 5 sekunder.
9. Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
10. Kassér EDC løsning (trin 1,6) og forberede en ny stikprøve på 10 mg / ml EDC i vand som ovenfor (trin 1,6).
11. Tilføj endnu en 2,5 μl af frisk EDC løsning på mikrokugler og vortex i 5 sekunder.
12. Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
13. Vask perlerne ved at tilsætte 1 ml 0,02% Tween 20. Vortex (valgfrit sonikeres i 20 sekunder som godt) at resuspendere perlerne.
14. Centrifuger 14000 xg 1 minut. Fjern og kassér supernatanten.
15. Vask perlerne igen ved at tilsætte 1 ml 0,1% sodium dodecyl sulfat (SDS). Vortex (valgfrit sonikeres i 20 sekunder som godt) at resuspendere perlerne.
16. Centrifuger 14000 xg 1 minut. Fjern og kassér supernatanten.
17. Resuspender perlerne i 100 μl (25 μl) af Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Optælle perlerne i en haemocytometer eller Coulter counter til at bestemme bestanden koncentration.
19. Forbered en microsphere Master Mix ved at fortynde hver perle til en endelig koncentration på 100 perler / mikroliter i TE buffer. Pool koblet perler, der svarer til det ønskede kompleks af analysen (fx for en 10-kompleks analyse, mix 10 forskellige koblet perler på en slutkoncentration på 100/μl af hver perle).
20. Opbevar microsphere Master Mix ved 4 ° C i mørke. Blandingen kan opbevares i flere måneder, hvis de holdes under disse forhold.

2. Chaperonin 60 universelle mål (cpn60 UT) amplikonet produktion og generering af enkelte tråde.

1. Generer polymerase chain reaction (PCR) produkt for hver prøve. Medtag phosphorothioate-og biotin-modificeret 5 'primer sæt (tabel 1). Se tabel 3 for volumen for at blande og koncentrationer.
2. Umiddelbart efter PCR er færdig, tilsættes 2 μl (20 enheder) af T7 exonuclease til hvert PCR-rør (PCR-buffer vil være tilstrækkeligt for de T7 reaktion). Inkubér reaktionen ved stuetemperatur (~ 22-25 ° C) i 40 minutter.
3. I slutningen af ​​denne inkubation tilsættes 12,5 μl af 0,5 M ethylen diamin tetra-acetat (EDTA) pH 8,0 og blandes. Dette giver i alt ~ 64.5μl af enkelt-strenget PCR produkt.

3. Hybridisering af single-strandede PCR produkt til oligonucleotid-koblede polystyren perler.

1. Opvarmning af instrumentet til 60 ° C for at bevare hybridisering temperatur under analysen. Tænd på platformen varmer ved hjælp af instrumentets software og sørg for at bruge messing varmeblok, der passer til PCR-stil plade, der indeholder den hybridiserede perle blanding.
2. Resuspender microsphere Master Mix (trin 1,20) med en pipette, undlade en passende mængde i et eppendorfrør, cap røret, og sonikeres i et vandbad sonicator i 2 minutter. Alternativt, for at sikre absolut konsistens i perle resuspension kan microsphere Master Mix resuspenderes ved hvirvelblanding og pipettering, så sonikering som ovenfor, og derefter afgive den ønskede mængde i et polypropylen eppendorfrør.
3. Dispensér 17 μl af single-strandede PCR-produktet (trin 2.2) i de relevante brønde af en lav-profil, 96-brønds Lomme PCR-plade (Tabel 2). Tilsæt 33 μl af resuspenderet, sonciated perle blandingen til hver brønd. Dæk med silikoneetui (Tabel 2), og tryk forsigtigt.
4. Sæt pladen i thermocycler med et program for: 95 ° C i 5 min, 60 ° C i 10 min, 60 ° C hold, 60 ° C i 5 min, ende. Start programmet.
5. Gør frisk streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) løsning, du får brug for 25 μl per brønd (gøre flere brønde ekstra). Gør SA-PE ved at fortynde lager SA-PE (1 mg / ml) 01:50 til 20 mg / ml med 1x tetramethylammoniumhydroxid klorid (TMAC) buffer (3 M TMAC; 0,1% Sarkosyl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 4 mM EDTA, pH 8,0).
6. Når thermocycler bliver til 60 ° C hold skridt,åbne låget, skal du fjerne silikoneetui og tilføje SA-PE løsning direkte til hver brønd (MÅ IKKE tage pladen ud af thermocycler). Udskift silikoneetui, luk thermocycler låget og genoptage programmet.
7. Når programmet er færdig, tager pladen ud og hurtigt overføre det til Bioplex maskinen til at læse. Skiltet skal læses inden for 10 minutter. Læs ved 60 ° C sikrer, at Bioplex er opvarmet til denne temperatur. Vær sikker på, at sonden højden er justeret for at imødekomme den udnyttede plade, som beskrevet i brugermanualen for det anvendte instrument.
8. For nøjagtig perle og signal detektion, skal porten indstillingerne på Bioplex indstilles efter typen af ​​mikrosfærer, der anvendes. BioRad polystyren perler kræver en port indstilling af 4,335-10,000 mens magnetiske mikrokugler kræver en indstilling på 5.000-25.000. Der er også mulighed for at køre pladen ved hjælp af High PMT-indstilling, som øger reporter få værdi. Dette kan jegncrease intensiteten af ​​lavere signaler, men det er vigtigt, omfatter et passende negative kontrol som baggrund signal også vil blive øget.

4. Repræsentative resultater:

Et af vores mål i udviklingen og gennemførelsen af ​​denne analyse var at gøre det så enkle og strømlinede som muligt. Vi har derfor optimeret kritiske post-forstærkning skridt, herunder T7 exonuclease behandlingstid og hybridisering tid for at udvikle et forsøg, der kan afsluttes inden for en rimelig tidsramme. Som vist i figur 2A, T7 behandling af amplikon afgørende for signal generation, som de fleste prober havde lidt eller intet signal med kort eller ingen T7 behandling. Signalet øges lineært indtil ca 40 minutter, på hvilket tidspunkt signalet stigningen aftaget. Nogen forringelse af signalet blev observeret selv ved 2 timers T7 behandlingstid, hvilket indikerer, at phosphorothioate ændring af primere er meget effektiv til at forhindre Target Strand nedbrydning som beskrevet ^15. Vi valgte 40 minutter for T7 behandlingstid for at minimere den samlede protokollen tid, men det fremgår af figur 2A, at T7 behandlingen kan blive ved meget længere. Vi er også fast besluttet på effekten af ​​hybridisering tid på signal generation (Figur 2B) og fandt, at 10 minutter var nok for maksimal signal, som det var ingen yderligere stigning i signalet overholdt, også efter 4 timers hybridisering. Derfor blev en 10 minutters hybridisering skridt valgt, igen for at minimere den samlede analysen tid. Med disse resultater in mente og med hurtig dna-ekstraktion teknikker såsom InstaGene (Bio-Rad), kan den samlede analysen herunder dna-ekstraktion, PCR og Luminex analyser være afsluttet i 4-5 timer.

På en advarende note, kan niveauet for sammenlægning af polystyren perler under et Luminex eller Bioplex køre have en stor indvirkning på effektiviteten af ​​analysen. Den Bioplex software vil vise niveauet af perle aggregeringsniveau, der opstår, nårmere end en perle er opdaget i laser stien og resulterer i udelukkelse af hybridisering signal fra den samlede indtægt. Tilsyneladende perle sammenlægning kan også være forårsaget af partikler, der ikke er den korrekte størrelse for en enkelt perle, og kan endda være forårsaget af luftbobler. I alle disse begivenheder, er signalet fra perle samlet, luftboble eller partikel kasseres. I de fleste tilfælde finder vi, at perle sammenlægning er minimal (figur 3A) og målrettet på 100 tælle begivenheder for hver perle er let opnåelige. Men sommetider, perlerne viser en moderat (Figur 3B) eller svær (figur 3C) aggregeringsniveau. I disse tilfælde, da de fleste af de data, der kasseres, kan instrumentet have svært ved at nå 100 arrangementer hver perle type og resultaterne kan være tvivlsom. Den sonication trin (trin 3.2) er beregnet til at minimere perle sammenlægning. Hertil kommer, kan lagring af perler som en fortyndet microsphere Master Mix (trin 1.20) hjælp. Vi har bemærket, at udelukke TMAC fra hybridization buffer - at tilføje det til SA-PE fortyndingsmiddel i stedet (trin 3.5) - hjælper til at minimere perle sammenlægning. Hertil kommer, mens vi ikke har testet dette, er de nyere magnetiske perler til rådighed fra Luminex eller BioRad menes at vise mindre af en tendens til at aggregere.

Resultaterne af anvendelsen af en 5-plex Luminex række rettet mod G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, og L. gasseri sammen med tilsvarende Gram farvede vaginal podepind udstrygningspræparater er vist i figur 4. Disse prøver blev taget fra et enkelt individ på forskellige tidspunkter. Til tiden 0, blev de enkelte diagnosticeret med BV er baseret på Gram-farvning (Figur 4A) og Luminex resultaterne fra denne samme prøve (figur 4B) viser, at af de organismer, der er repræsenteret i array, G. vaginalis var mest udbredt, mens A. vaginae og L. iners var også positive. Ni dage senere, den enkelte var stadig BV positive, og signal for G. vaginalis var steget betydeligt, mens A. vaginae og L. iners stadig var positive. Vigtigere er det, efter denne tid den enkelte begyndte at overgangen til en normal mikrobiota som Gram-positive bakterier blev opdaget i udstrygninger (Figur 4A), mens signalet til G. vaginalis dalede, og signalet til L. iners steget (figur 4B). Af vores oprindelige definition af BV med denne metode (prøver positive for G. vaginalis og / eller A. vaginae blev betragtet BV positive) ^13, blev denne person BV positive på alle tidspunkter, selv om Gram-farvning ikke har kunnet påvise G. vaginalis i de to sidstnævnte tidspunkter. Med Luminex metoden beskrevet her, kan tendenser er let at sammenligne sequencing-baserede metoder, og resultaterne af Luminex analysen typisk bekræfte Gram-farvning ¹³ samtidig give yderligere oplysninger om organismen identitet og overflod.

Figur 1. Skematisk diagram af Luminex protokol for bestemmelse af mikrobiota profil af en kompleks klinisk eller miljømæssige prøve. Protokollen begynder med skabelon DNA, der er blevet udvundet fra den stikprøve af interesse. (1) Generer PCR-produktet fra template DNA ved hjælp af streng-specifikke biotinyleret, phosphorothioate-modificerede cpn60 UT PCR primere kombineret med umodificerede cpn60 UT PCR-primere (tabel 1), (2) Dette genererer en PCR Product Pool, der repræsenterer mikrobiota med biotin- phosphorothioate ændring på én streng, (3) Fordøj det dobbelt-strandede PCR-produkt med T7 exonuclease, som ikke kan forringe phosphorothioate-modificeret Strand og derfor genererer single-strandede DNA, der er ændret på 5 'ende med biotin, (4) Par polystyren perler til artsspecifikke cpn60 UT sonder - hver perle har en unik spektral adresse (angivet med perle farve), at jegs mærkbar af Luminex eller Bio-Plex instrument (5) Hybridiser single-strandede PCR-produkt genereret fra den stikprøve af interesse for suite af artsspecifikke oligonukleotide-koblede perler, (6) Tilføj streptavidin-phycoerythrin konjugat, der bindes til den biotinyleret single-strandede PCR-produkt, og fungerer som en indikator for hybridisering; (7) Bestem den spektrale adresse (perle identitet) og hybridisering signal intensitet ved hjælp af et Luminex eller Bio-Plex instrument. Mindst 100 perler tælles for hver perle identitet og median fluorescensintensitet (MFI) af phycoerythrin signalet er rapporteret som output. Op til 100 forskellige perler typer kan vurderes samtidigt, men en analyse, der viser den diskrimination af tre perle typer er illustreret. (8) Når MFI for PCR replikerer genereret fra den samme prøve er betydeligt større end den negative kontrol for en given perle (one-tailed Students t-test, p <0,05), er prøven anses for at være positiv for den pågældende organisme.

Figur 2. Optimering af Luminex analyse parametre. Fem forskellige sonder målrettet til Peptostreptococcus anaerobius blev brugt med amplikationsprodukter genereres fra en blandet skabelon bestående af plasmider, der indeholder de klonede cpn60 UT på 20 bakterier er kendt for at være forbundet med vagina, herunder P. anaerobius. (A). Effekt af T7 exonuclease behandlingstid. Protokollen, der er beskrevet ovenfor, blev fulgt, men tidspunktet for behandlingen med T7 exonuclease blev varieret forud for hybridisering og den mediane fluorescensintensitet (MFI) blev bestemt i alle sonder. (B). Effekt af hybridisering tid. Protokollen, der er beskrevet ovenfor, blev fulgt med en bred vifte af hybridisering gange. Det samme sæt af sonder blev anvendt med en amplikon genereret fra samme skabelon som i A og den mediane fluorescensintensitet (MFI) blev bestemt i alle sonder.

">
Figur 3. Bestemmelse af perle sammenlægning med Bioplex software. Tre eksempler er givet af Bioplex kører i, hvor niveauet for perle sammenlægning (A) acceptabel (5%), (B) borderline (50%), og (C) uacceptable (80%).

Figur 4. Påføring af en 5-plex Luminex array til BV diagnose i sekventielle prøver taget fra den samme person. (A). Gram-farvede objektglas viser de traditionelle diagnostiske anvendes til at vurdere hver enkelt prøve for BV. (B). Anvendelse af en 5-plex Luminex vifte forberedt og gennemført som beskrevet i denne protokol til de samme fire prøver vist i (A). Bakteriel mål, hvor MFI-signalet var signifikant positiv med vores definition (one-tailed Students t-test, p <0,05) er markeret med en stjerne (*).

Discussion

Det særlige ved signalet generation er af afgørende betydning, og du skal være sikker på, at signalet observerede virkelig afspejler påvisning af amplikonet genereres fra den pågældende organisme. Software som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan hjælpe med at designe sonder, der vil hybridisere effektivt, men de kan eller ikke kan på tværs af hybridisere til ikke-målarter. Når universelle PCR primere anvendes som beskrevet i denne protokol, er det vigtigt at huske på, at den genererede amplikonet repræsenterer alle de organismer, der findes i prøven. Det er derfor vigtigt at analysere potentialet sonder mulighed for cross-hybridisering ved at sammenligne sekvenser foreslået af sonden design software til cpnDB, en database over cpn60 UT sekvenser ^16, sonder, der matcher flere organismer, der skal undgås, hvis muligt . Desuden, når potentielt specifikke prober er identificeret, har vi taget en tilgang til sonde validering, hvor et komplekst, kunstige Template er parat svarende til den klonede cpn60 UT af en række organismer, der er forbundet med mikrobiota af interesse ^13. Amplikon Derefter genereres fra den komplette "blandede panel", herunder målet skabelonen, og signalet er i forhold til, at der genereres fra en anden skabelon består af de blandede panelet, der ikke indeholder målorganismen er cpn60 UT. Sonder, der genererer en høj signal-til-støj-forhold (hvor signalet er genereret fra hele panelet og støjen er genereret fra panelet, uden at målet skabelonen) er udvalgt til at indgå i den endelige analyse. Vi har typisk analyseret 4-5 muligt sonder for hver enkelt organisme, før du vælger en for optagelse i den endelige Luminex array.

Definitionen af ​​et positivt resultat er et emne, der skal overvejes. Vi har konstateret, at forskellige sonder har i sagens natur forskellige signal-støj-forhold, så vi besluttede på en metode, hvorved et positivt resultat er defined ved en meget simpel statistisk test: den studerendes t-test (one-tailed). Et positivt resultat er defineret ved at sammenligne MFI af prøven til "ingen skabelon" kontrol, og når MFI'en er betydeligt højere end den kontrol på p <0,05, er resultatet anses for at være positiv for den pågældende organisme. Normalt to uafhængigt genereret amplikationsprodukter er hver især testet i to eksemplarer. Selvom PCR og T7 exonuclease skridt skabe omkring 64,5 μl af single-strandede PCR-produktet (trin 2,3) og kun 17 μl af dette er brugt til hybridisering (trin 3.2), hvilket er tilstrækkeligt for 3 hybridisering assays, vi normalt analyserer dubletter fra to forstærkninger til giver en iboende teknisk gentage uden brug af et uforholdsmæssigt stort antal brønde.

Et aspekt af denne analyse, som vi har undersøgt, er dens semi-kvantitative egenart. MFI-signal fra en given sonde korrelerer godt til qPCR-bestemmes overflod af en given organisme (Spearman rank korrelationskoefficient & rho, = 0,4686, p <0,0001) ^13, men det dynamiske område er begrænset; signalet tendens til at mætte ved højere målorganismen niveauer, som forventet, da amplikon analyseret efter end-point PCR af 40 cyklusser. Fordi det er semi-kvantitative, kan tendenser i organismen overflod blive overvåget og mønstre observeret (holde det forbehold i tankerne med hensyn til signal mætning ved højere mængderne). For eksempel viser figur 4 en profil af vaginal mikrobiota af en individuel over tid, da det skifter fra BV til normal. Da dette sker, det signal, der svarer til G. vaginalis (et BV-associeret organisme ¹⁷⁾ stiger, og derefter aftager, mens i løbet af overvågningen tid signalet for L. iners stigninger. Tilsvarende Gram pletter, den nuværende "gold standard" for BV diagnose, viser et mønster, hvor Gram positive baciller er i første omgang fraværende, men kan påvises på senere tidspunkter. Luminex metode både identificerer organismer, der findes i prøven, og giver sogle oplysninger om deres relative mængder. Denne type oplysninger kan potentielt anvendes til at overvåge prøver af enhver form for uønskede tendenser i mængderne af særlige organismer og kan levere disse data til en lang række organismer på samme tid.

Det er vigtigt, er denne metode ikke begrænset til profilering af vaginal mikrobiota og med rimelighed kan anvendes på hvilket som helst miljø, hvor detektion og delvis kvantificering af en række målorganismer er ønskeligt. Ved anvendelse af metoden til andre miljøer, er det vigtigt at overveje muligheden af PCR hæmning forekommende, som hæmmere af PCR almindeligt co-rense med DNA fra mange miljøer ^18. Når PCR-inhibition er et problem, kan prøven enten fortyndet eller renses yderligere for at generere tilstrækkelig signal til denne analyse.