Multiplex detektion av bakterier i komplex klinisk och miljöprover med Oligonucleotide-kopplad fluorescerande mikrosfärer

Summary

Vi beskriver en multiplex metod för detektion av mikroorganismer i ett prov med hjälp oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor. Amplicon från alla organismer i ett prov är hybridiseras till en panel bestående av sond-kopplade pärlor. En Luminex eller Bio-Plex instrument används för att fråga varje pärla för bead typ och hybridisering signal.

Abstract

Bakteriell vaginos (BV) är ett återkommande polymikrobiella syndrom som kännetecknas av en förändring i den "normala" mikroorganismer från Lactobacillus dominerade till en mikroorganismer som domineras av ett antal bakteriearter, inklusive Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae och andra ^1-3. Detta tillstånd är förenat med en rad negativa hälsoeffekter, inklusive hiv förvärv ^4, och det kan vara svårt att hantera kliniskt ^5. Dessutom har diagnosen BV förlitat sig på användning av Gram fläckar av vaginal provstickan fläckar som är skårade på olika numeriska kriterier ^6,7. Även om denna diagnos är enkel, billig och väl lämpad för begränsade resurser inställningar kan man drabbas av problem relaterade till subjektiva tolkningar och det inte ge en detaljerad profil av sammansättningen av vaginala mikroorganismer ^8. Nyligen djupa sekvensering ansträngningar har avslöjat ett rikt, mångsidigt vaginal mikrobiota medtydliga skillnader mellan prover från personer som diagnostiseras med BV jämfört med de individer som anses normalt ^9,10, vilket har resulterat i att identifiera ett antal potentiella mål för molekylär diagnostik av BV ^11,12. Dessa studier har gett en mängd användbar information, men djupt sekvensering är ännu inte praktiskt som en diagnostisk metod i en klinisk miljö. Vi har nyligen beskrivit en metod för att snabbt profilering underlivet mikroorganismer i en multiplex format med oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor med upptäckt på en Luminex plattform ^13. Denna metod, precis som nuvarande gramfärgning-baserade metoder, är snabb och enkel men lägger till ytterligare en fördel att utnyttja molekylära kunskap som sekvensering studier i sond design. Denna metod ger därför ett sätt att profilera de stora mikroorganismer som finns i en vaginal pinnen som kan användas för att diagnostisera BV med hög specificitet och sensitivitet compared att gramfärgning samtidigt som den ger ytterligare information om arter närvaro och överflöd i en semikvantitativ och snabbt sätt. Denna multiplex metod är utbyggbart långt utöver utbudet av nuvarande kvantitativa PCR-analyser för vissa organismer, som för närvarande är begränsad till 5 eller 6 olika tester på ett enda prov ^14. Viktigt är metoden inte begränsad till att upptäcka bakterier i slidan kompresser och kan lätt anpassas för att snabbt profilen nästan alla mikrobiella av intresse. Till exempel har vi nyligen börjat tillämpa denna metod för utveckling av diagnostiska verktyg för användning i avloppsreningsverk.

Protocol

Denna metod användes i forskningen redovisas i Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

En schematisk bild som visar hela förfarandet presenteras i Figur 1.

1. Bead koppling

Detta beskriver de metoder som skall användas för koppling oligonukleotid prober till polystyren Luminex pärlor (se tabell 2). Volymerna är anpassade något för utvärdering av nya fångar sonder på försök, dessa volymer anges inom parentes.

1. Ta bort 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) pulver från -20 ° C exsickator och värm till rumstemperatur.
2. Resuspendera mikrosfärer av sonciation i ett vattenbad sonicator i 20 sekunder, sedan vortexa ca 20 sekunder.
3. Överför 400 l (100 l) av mikrosfärer till ett Eppendorf-rör (detta motsvarar 5x10 ⁶ eller 1.25x10 ⁶ mikrosfärer). Luminex föreslår att man utnyttjar låg proteinbindning mikrocentrifugrör (t.ex. Eppendorf Protein LoBind rör, katalognummer 0030 108,094) för att förhindra att frikopplas pärlorna fastnar rören och stör pärla återhämtning. Vi har inte funnit att detta är ett problem med vanliga rör polypropylen mikrocentrifug, som vi normalt använder (t.ex. VWR katalognummer 87.003-298).
4. Pellet på 14 tusen xg i 1 minut. Avlägsna och kassera supernatanten.
5. Resuspendera mikrosfärer i 50 l (12,5 l) i rumstemperatur 0,1 m 2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) pH 4,5.
6. Bered en färsk lösning av EDC vid 10 mg / ml i vatten.
   1. Förbered mindre än 1 ml av denna lösning genom vägning 5-10 mg av EDC på en analytisk skala, sedan tillsätta vatten till 10 mg / ml.
7. Tillsätt 1 nmol av 5'-amino C12-modifierad capture oligonukleotid (tabell 2) till mikrosfärer och blanda genom att vortexa. 1 nmol är 5 ìl av 200 mikroM oligonukleotid.
8. Tillsätt 2,5 l färska EDC lösning på mikrosfärer och blanda genom att vortexa i 5 sekunder.
9. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker.
10. Kasta EDC lösningen (steg 1,6) och förbereda ett nytt prov på 10 mg / ml EDC i vatten som ovan (steg 1,6).
11. Lägg till ytterligare 2,5 l färska EDC lösning på mikrosfärer och vortexa i 5 sekunder.
12. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker.
13. Tvätta pärlor genom att tillsätta 1 ml 0,02% Tween 20. Vortex (valfritt Sonikera 20 sekunder också) för att resuspendera kulorna.
14. Centrifugera 14 tusen xg 1 minut. Avlägsna och kassera supernatanten.
15. Tvätta pärlor igen genom att tillsätta 1 ml 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS). Vortex (valfritt Sonikera 20 sekunder också) för att resuspendera kulorna.
16. Centrifugera 14 tusen xg 1 minut. Avlägsna och kassera supernatanten.
17. Resuspendera pärlor i 100 l (25 l) av Tris-EDTA (TE) buffert [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Räkna på pärlorna i ett haemocytometer eller Coulter räknare för att bestämma beståndet koncentration.
19. Förbered en mikrosfär Master Mix genom att späda varje kula till en slutlig koncentration av 100 pärlor / l i TE buffert. Pool tillsammans pärlor som motsvarar den önskade Plex i analysen (t.ex. för en 10-Plex analys, blanda 10 olika kopplad pärlor på en slutlig koncentration av 100/μl av varje pärla).
20. Förvara mikrosfär Master Mix i 4 ° C i mörker. Blandningen kan förvaras i månader om den förvaras under dessa förhållanden.

2. Chaperonin 60 universella mål (cpn60 UT) amplicon produktion och generering av enstaka trådar.

1. Generera polymerase chain reaction (PCR) produkt för varje prov. Inkludera phosphorothioate-och biotin-modifierad 5 "primer set (tabell 1). Se tabell 3 för volymer att blanda och koncentrationer.
2. Omedelbart efter PCR är klar, tillsätt 2 l (20 enheter) av T7 exonuclease till varje PCR-rör (PCR buffert räcker för T7 reaktion). Inkubera reaktionen vid rumstemperatur (~ 22-25 ° C) i 40 minuter.
3. I slutet av denna inkubationen, tillsätt 12,5 l 0,5 m etylendiamintetraättiksyra tetraacetic (EDTA) pH 8,0 och blanda. Detta ger ett totalt ~ 64.5μl av enkelsträngade PCR-produkt.

3. Hybridisering av enkelsträngade PCR-produkt till oligonukleotid-kopplade polystyren pärlor.

1. Prewarm instrumentet till 60 ° C för att bibehålla hybridisering temperatur under analysen. Slå på plattformen värmaren med instrumentets programvara och se till att använda blocket mässing uppvärmning som passar PCR-stil platta som innehåller den hybridiserade pärla blandningen.
2. Resuspendera mikrosfär Master Mix (steg 1,20) med en pipett, dosera en lämplig summa till ett Eppendorf-rör, mössa röret, och låt ligga i ett vattenbad sonicator i 2 minuter. Alternativt, för att säkerställa absolut konsekvens i pärlan resuspension kan mikrosfär Master Mix ska återsuspenderade genom att vortexa och pipettering, sedan ultraljudsbehandling som ovan, därefter fördela önskad mängd i en polypropylen Eppendorf-rör.
3. Dispensera 17 ìl enkelsträngade PCR-produkten (steg 2,2) i lämpliga brunnar i en låg profil med 96 brunnar Thermowell PCR-platta (tabell 2). Tillsätt 33 l återsuspenderad, sonciated pärla blandning i varje brunn. Täck med silikon (tabell 2) och knacka försiktigt.
4. Sätt plåten i termocykler med ett program av: 95 ° C i 5 min, 60 ° C i 10 min, 60 ° C håll, 60 ° C i 5 min, slut. Starta programmet.
5. Gör färska streptavidin-fykoerytrin (SA-PE) lösning, du kommer att behöva 25 l per brunn (göra flera brunnar extra). Gör SA-PE-lösning genom att späda lager SA-PE (1 mg / ml) 01:50 till 20 mikrogram / ml med 1x tetramethylammonium klorid (TMAC) buffert (3 M TMAC, 0,1% Sarkosyl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 4 mM EDTA, pH 8,0).
6. När termocykler kommer till 60 ° C håller steg,öppna locket, ta bort silikon och lägga SA-PE-lösningen direkt i varje brunn (INTE ta tallriken ur termocykler). Sätt tillbaka i silikon, stäng termocykler locket och återuppta programmet.
7. När programmet är klar, ta med sig tallriken ut och snabbt överföra den till BioPlex maskinen att läsa. Tavla måste läsas inom 10 minuter. Läs vid 60 ° C, se till att BioPlex har varit uppvärmd till denna temperatur. Var säker på att sonden höjden har justerats för att rymma plattan används, som beskrivs i bruksanvisningen för den använda instrumentet.
8. För noggrann pärla och signal upptäckt, måste porten inställningar på BioPlex ställas in beroende på vilken typ av mikrosfärer som används. BioRad polystyren kulor kräver en grind inställning av 4,335-10,000 medan magnetiska mikrosfärer kräver en inställning av 5,000-25,000. Det finns också möjlighet att köra plattan med den höga PMT inställningen som ökar värdet reporter vinna. Detta kan jagncrease intensiteten i lägre signaler men det är viktigt innefatta en lämplig negativ kontroll som bakgrund signalen kommer också att öka.

4. Representativa resultat:

Ett av våra mål att utveckla och genomföra denna analys var att göra det så enkla och enhetliga som möjligt. Vi optimerat alltså den kritiska post-amplifiering åtgärder, inklusive T7 exonuclease behandlingstiden och hybridisering tid för att utveckla en analysmetod som kan genomföras på en rimlig tidsram. Som framgår av figur 2A är T7 behandling av amplicon viktiga för signal generationen, eftersom de flesta sonder hade liten eller ingen signal med kort eller ingen T7 behandling. Signalen ökade linjärt fram till ungefär 40 minuter, då signalen att öka långsammare. Ingen nedbrytning av signalen observerades även vid 2 timmars T7 behandlingstid, vilket indikerar att phosphorothioate ändring av primers är mycket effektivt för att förhindra siktat strand nedbrytning beskrivs som ^15. Vi valde 40 minuter för T7 behandlingstid för att minimera den totala protokollet, men det framgår av Figur 2A som T7 behandling kan pågå mycket längre. Vi har också bestämt effekten av hybridisering tid på signalen generationen (Figur 2B) och fann att 10 minuter var tillräckligt för maximal signal, var som ingen ytterligare ökning av signalen observeras ens efter 4 timmar av hybridisering. Därför var en 10 minuters hybridisering steg väljs igen för att minimera den totala analysen tiden. Med dessa resultat i åtanke, och med snabba metoder för DNA-extraktion som InstaGene (Bio-Rad), kan den övergripande analysen inklusive DNA-extraktion, PCR och Luminex analys fyllas i 4-5 timmar.

På ett varnande notering kan den aggregeringsnivå av polystyren pärlor under en Luminex eller BioPlex köra ha en stor inverkan på effektiviteten i analysen. Den BioPlex mjukvaran visar nivån pärla aggregeringsnivå, som uppstår närmer än en pärla detekteras i laser vägen och resulterar i ett uteslutande av hybridisering signalen från aggregat. Skenbar pärla aggregering kan också orsakas av partiklar som inte är rätt storlek för en enda pärla, och kan även orsakas av luftbubblor. I varje av dessa händelser, är signalen från pärla samlade, luftbubbla, eller partikel kasseras. I de flesta fall finner vi att pärla aggregering är minimal (Figur 3A) och den målsatta nivån på 100 räkna händelser för varje kula är lätt att uppnå. Ibland, men pärlorna visar en måttlig (Figur 3B) eller svår (figur 3C) aggregeringsnivå. I dessa fall, eftersom de flesta av data tas bort, kan instrumentet ha problem att nå 100 händelser per pärla typ och resultatet kan ifrågasättas. Den sonication steg (steg 3,2) är tänkt att minimera pärla aggregering. Dessutom kan lagra pärlorna som en utspädd mikrosfär Master Mix (steg 1,20) hjälp. Vi har märkt att förutom TMAC från hybridization buffert - att lägga till det SA-PE spädningsmedel istället (steg 3,5) - hjälper till att minimera pärla aggregering. Dessutom, medan vi inte har testat detta, är de nyare magnetiska kulor tillgängliga från Luminex eller BioRad tänkt att visa mindre av en tendens att aggregera.

Resultaten av tillämpningen av en 5-Plex Luminex rad riktade G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, och L. gasseri tillsammans med motsvarande Gram färgade vaginala kompress utstryk visas i Figur 4. Dessa prover togs från en enda individ vid flera tidpunkter. Vid tiden 0, var den enskilda diagnosen BV baseras på Gramfärgning (Figur 4A) och Luminex resultaten från denna samma prov (Figur 4B) visar att av de organismer representerade i arrayen, G. vaginalis var mest förekommande, medan A. vaginae och L. iners var också positiva. Nio dagar senare var den enskilde fortfarande BV positiva och Signal för G. vaginalis hade ökat avsevärt samtidigt som A. vaginae och L. iners var fortfarande positiv. Viktigt efter denna tid individen började övergången till en normal mikroorganismer som grampositiva stavar blev upptäckas i utstryk (Figur 4A) medan signalen för G. vaginalis avtog och signalen för L. iners ökat (Figur 4B). Genom vår ursprungliga definition av BV med denna metod (prov positiva för G. vaginalis och / eller A. vaginae ansågs BV positivt) ^13, var denna person BV positiva vid alla tidpunkter, även om gramfärgning misslyckats med att upptäcka G. vaginalis i de två senare tidpunkter. Med Luminex metoden som beskrivs här, kan trender enkelt jämföras med sekvensering-baserade metoder, och resultaten av Luminex analysen vanligtvis bekräfta Gram fläckar ¹³ samtidigt som den ger ytterligare information om organismens identitet och överflöd.

Figur 1. Schematisk beskrivning av Luminex-protokollet för att bestämma mikrobiota profilen av en komplex klinisk eller miljömässiga prov. Protokollet börjar med templat-DNA som har utvunnits ur urvalet av intresse. (1) Generera PCR-produkten från en mall DNA med strand-specifika biotinylerad, phosphorothioate-modifierade cpn60 UT PCR tillsammans med omodifierade cpn60 UT PCR primers (tabell 1), (2) Detta genererar en PCR-produkt pool representerar mikrobiota med biotin- phosphorothioate modifiering på en strand, (3) Digest dubbel-strängat PCR-produkten med T7 exonuclease, som inte kan försämra phosphorothioate modifierade Strand och därmed genererar enda DNA som är modifierad på 5 'änden med biotin, (4) Par polystyren pärlor till artspecifika cpn60 UT prober - varje pärla har en unik spektral adress (anges med pärla färg) som jags skönjas genom Luminex eller Bio-Plex instrument, (5) hybridisera den enkelsträngade PCR-produkt som genererats från urvalet av intresse för den svit av artspecifika oligonukleotid-kopplad pärlor, (6) Lägg streptavidin-fykoerytrin konjugat som binder till den biotinylerad enkelsträngade PCR-produkt och fungerar som en indikator på hybridisering, (7) Bestäm spektrala adress (pärla identitet) och hybridisering signalstyrka med hjälp av en Luminex eller Bio-Plex instrument. Minst 100 pärlor räknas för varje granulum identitet och medianen fluorescensintensitet (MFI) i fykoerytrin signalen rapporteras som utdata. Upp till 100 olika pärla typer kan utvärderas samtidigt, men en analys visar diskrimineringen av tre pärla typer illustreras. (8) När MFI-PCR replikerar genereras från samma prov är betydligt större än den negativa kontrollen för en given pärla (ensidigt Students t-test, p <0,05) skall provet anses vara positivt för den organism.

Figur 2. Optimering av Luminex analys parametrar. Fem olika sonder riktade till Peptostreptococcus anaerobius användes med amplicons genereras från en blandad mall som består av plasmider som innehåller den klonade cpn60 UT på 20 bakterier som förknippas med slidan, inklusive P. anaerobius. (A). Effekt av T7 exonuclease behandlingstid. Protokollet beskrivs ovan följdes men tiden för behandling med T7 exonuclease var varierande före hybridisering och medianen fluorescensintensitet (MFI) fastställdes för alla givare. (B). Inverkan av hybridisering tid. Protokollet beskrivs ovan följdes med olika hybridisering gånger. Samma typer av sonder använts med en amplicon genereras från samma mall som i en och medianen fluorescensintensitet (MFI) fastställdes för alla givare.

">
Figur 3. Bestämning av pärla aggregering med BioPlex programvara. Tre exempel ges på BioPlex körningar där nivån pärla aggregering är (A) accepteras (5%), (b) borderline (50%), och (c) oacceptabel (80%).

Figur 4. Tillämpning av ett 5-Plex Luminex array BV diagnos i sekventiella prov från samma individ. (A). Gram-färgade diabilder som visar traditionella diagnostiska används för att bedöma varje prov för BV. (B). Tillämpning av en 5-Plex Luminex rad förberedda och genomförs som beskrivs i detta protokoll till samma fyra prover som visas i (A). Bakteriell mål vars MFI-signalen var signifikant positivt med vår definition (ensidigt Students t-test, p <0,05) är markerade med en asterisk (*).

Discussion

Specificiteten av signal generation är av avgörande betydelse, du måste vara säker på att signalen observeras verkligen återspeglar upptäckt av amplicon genereras från den skadegöraren. Program som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan hjälpa till att utforma sonder som kommer hybridisera effektivt, men de kan eller inte kan över hybridiseras till icke-målarter. När samhällsomfattande PCR används som beskrivs i detta protokoll är det viktigt att hålla i minnet att amplicon genererade representerar alla de organismer som finns i provet. Det är därför viktigt att analysera potentiella givare för möjligheten till gränsöverskridande hybridisering genom att jämföra sekvenser föreslås av sonden design mjukvara till cpnDB, en databas med cpn60 UT sekvenser ^16, sonder som matchar flera organismer ska kunna undvikas om möjligt . Dessutom, när potentiellt specifika prober är identifierade, har vi tagit en metod för att undersöka validering som en komplex, konstgjorda template är beredd motsvarar den klonade cpn60 UT av en rad olika organismer i samband med mikroorganismer av intresse ^13. Amplicon är då genereras från den kompletta "blandade panel", inklusive målet mallen, och signalen jämförs med genereras från en andra mall bestående av blandade panelen som inte innehåller målet organismens cpn60 UT. Sonder som genererar ett högt signal-brus-förhållande (där signalen genereras från hela panelen och bullret genereras från panelen utan att målet mall) väljs att ingå i den slutliga analysen. Vi har normalt analyserat 4-5 möjligt prober för varje målorganismen innan du väljer en för att ingå i den slutliga Luminex array.

Definitionen av ett positivt resultat är en fråga som måste övervägas. Vi har funnit att olika givare har i sig olika signal-brus-förhållande, så vi beslutade om en strategi där ett positivt resultat tydligt definieraED med en mycket enkel statistisk test: Students t-test (ensidigt). Ett positivt resultat definieras genom att jämföra MFI av provet till "ingen mall" kontroll, och när MFI är betydligt högre än i kontrollgruppen vid p <0,05, är resultatet anses vara positivt för den organism. Normalt två oberoende genereras amplicons är var och testas i duplikat. Även om PCR och T7 steg exonuclease skapa cirka 64,5 ìl enkelsträngade PCR-produkten (steg 2,3) och endast 17 ìl av detta används för hybridisering (steg 3,2), tillräckligt för 3 hybridisering analyser, analyserar vi normalt dubbletter från två förstärkningar till ge en inneboende tekniska replikera utan att använda ett alltför stort antal brunnar.

En aspekt av denna analys som vi har undersökt är den semi-kvantitativa art. MFI-signal från en given sond korrelerar väl till qPCR bestämda överflöd av en viss organism (Spearmans rang korrelationskoefficient & Rho, = 0,4686, p <0,0001) ^13, men det dynamiska omfånget är begränsat, signalen tenderar att mätta på högre nivåer målorganismen, som förväntat eftersom amplicon analyseras efter ändpunkt PCR i 40 cykler. Eftersom det är semikvantitativ, kan trender i organismen överflöd övervakas och mönster observerades (hålla varning i åtanke om signalen mättnad vid högre abundances). Till exempel visar Figur 4 en profil av vaginal mikrobiota en enskild över tiden som det ändras från BV till det normala. Då detta inträffar, den signal som motsvarar G. vaginalis (ett BV-associerad organism ¹⁷⁾ ökar och avtar, medan under loppet av den övervakning tid signalen för L. iners ökar. Motsvarande Gram fläckar, den nuvarande "gyllene standarden" för BV diagnos, visar ett mönster där grampositiva bakterier initialt frånvarande men är mätbara i senare tidpunkter. Luminex metoden både identifierar de organismer som finns i provet och ger erOME information om deras relativa förekomsten. Denna typ av information skulle kunna användas för att övervaka prover av något slag för oönskade trender i bestånd av särskilda organismer och kan tillhandahålla denna data för ett stort antal organismer samtidigt.

Viktigare är att denna metod inte begränsat till profilering av vaginal mikrobiota och rimligen kan tillämpas på alla miljö som upptäckt och partiell kvantifiering av en rad målorganismer är önskvärt. Vid tillämpning av metoden till andra miljöer, är det viktigt att överväga möjligheten av PCR-hämning sker, eftersom inhibitorer av PCR ofta tillsammans rena med DNA från många miljöer ^18. När PCR-hämning är en fråga, kan provet antingen spädas eller renas ytterligare i syfte att generera tillräcklig signal för denna analys.