Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Summary

Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

Abstract

Vaginosi batterica (BV) è una sindrome polimicrobica ricorrente che è caratterizzata da un cambiamento nel microbiota "normale" da Lactobacillus dominato ad un microbiota dominato da un numero di specie batteriche, tra cui Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e altri ^1-3. Questa condizione è associata a una serie di esiti negativi per la salute, compreso l'HIV acquisizione ^4, e può essere difficile da gestire clinicamente ^5. Inoltre, la diagnosi di BV ha invocato l'uso della colorazione di Gram di strisci tampone vaginale che sono incise su vari criteri numerici ^6,7. Anche se questa diagnosi è semplice, economico e adatto a risorse limitate, può soffrire di problemi legati ad interpretazioni soggettive e non dà un profilo dettagliato della composizione del microbiota vaginale ^8. I recenti sforzi di sequenziamento profondo hanno rivelato una ricca e diversificata flora batterica vaginale, conchiare differenze tra campioni prelevati da individui che sono diagnosticati con BV rispetto a quegli individui che sono considerati normali ^9,10, che ha portato alla identificazione di un numero di potenziali bersagli per la diagnosi molecolare di BV ^11,12. Questi studi hanno fornito una grande quantità di informazioni utili, ma sequenziamento profondo non è ancora pratico come metodo diagnostico in ambito clinico. Abbiamo recentemente descritto un metodo rapido per il profiling del microbiota vaginale in un formato multiplex con oligonucleotidi accoppiati perline fluorescenti con rilevamento su una piattaforma Luminex ^13. Questo metodo, come la corrente colorazione di Gram metodi basati, è rapido e semplice, ma aggiunge l'ulteriore vantaggio di sfruttare le conoscenze molecolari derivanti da studi di sequenziamento nella progettazione della sonda. Questo metodo fornisce quindi un modo per profilo i microrganismi più importanti che sono presenti in un tampone vaginale che può essere utilizzato per diagnosticare BV con elevata specificità e sensibilità compared a macchia Gram fornendo ulteriori informazioni sulla presenza e abbondanza delle specie in modo semi-quantitativo e rapida. Questo metodo multiplex è espandibile ben oltre la portata della corrente analisi PCR quantitativa per gli organismi particolari, che attualmente è limitato a 5 o 6 test differenti in un singolo campione ^14. È importante sottolineare che il metodo non si limita alla rilevazione di batteri nei tamponi vaginali e può essere facilmente adattato al profilo rapidamente quasi tutte le comunità microbica di interesse. Per esempio, abbiamo recentemente iniziato ad applicare questa metodologia per lo sviluppo di strumenti diagnostici per l'impiego in impianti di trattamento delle acque reflue.

Protocol

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Un diagramma schematico raffigurante la procedura generale è presentato nella figura 1.

1. Perlina di accoppiamento

Questo descrive i metodi da utilizzare per l'accoppiamento sonde oligonucleotidiche al polistirolo perle di Luminex (vedi tabella 2). I volumi sono leggermente adattati per la valutazione delle sonde di cattura nuovo in prova, questi volumi sono indicati tra parentesi.

1. Rimuovere 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimmide HCl (EDC) in polvere da -20 ° C e caldo essiccatore a temperatura ambiente.
2. Risospendere le microsfere da sonciation in un sonicatore bagnomaria per 20 secondi, quindi vortex circa 20 secondi.
3. Trasferire 400 microlitri (100 microlitri) di microsfere di una provetta Eppendorf (ciò corrisponde a 5x10 ⁶ o 1.25x10 ⁶ microsfere). Luminex consiglia l'utilizzo di tubi in microcentrifuga a basso legame con le proteine ​​(per esempio tubi Eppendorf LoBind proteine, numero di catalogo 0030 108,094) per evitare che le perle non accoppiato di attaccarsi ai tubi e interferendo con recupero tallone. Non abbiamo trovato che questo è un problema utilizzando le normali tubi da microcentrifuga in polipropilene, che si utilizzano in genere (ad esempio, numero di catalogo VWR 87003-298).
4. Pellet a 14000 xg per 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante.
5. Risospendere le microsfere in 50 microlitri (12,5 mL) di temperatura ambiente 0,1 M 2 - (N-Morpholino) etano acido (MES) pH 4.5.
6. Preparare una soluzione fresca di EDC a 10 mg / ml in acqua.
   1. Preparare meno di 1 ml di questa soluzione pesando 5-10 mg di EDC su una bilancia analitica, poi l'aggiunta di acqua a 10 mg / ml.
7. Aggiungere 1 nmol di 5'-amino oligonucleotide catturare C12-modificato (Tabella 2) a microsfere e mescolare nel vortex. 1 nmol è di 5 ml di 200 mM oligonucleotide.
8. Aggiungere 2,5 ml di soluzione fresca EDC per le microsfere e mescolare nel vortex per 5 secondi.
9. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
10. Scartare la soluzione EDC (passo 1,6) e preparare un nuovo campione dei 10 mg / ml EDC in acqua come sopra (passo 1,6).
11. Aggiungere altri 2,5 ml di soluzione fresca EDC per le microsfere e vortex per 5 secondi.
12. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
13. Lavare le perle con l'aggiunta di 1 ml di 0,02% di Tween 20. Vortex (opzionale ultrasuoni per 20 secondi) in modo da risospendere le sfere.
14. Centrifugare 14000 xg 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante.
15. Lavare le perle di nuovo con l'aggiunta di 1 ml di solfato di sodio 0,1% dodecil (SDS). Vortex (opzionale ultrasuoni per 20 secondi) in modo da risospendere le sfere.
16. Centrifugare 14000 xg 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante.
17. Risospendere le sfere in 100 l (25 mL) di Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0].
18. Enumerare le perle in un emocitometro o contatore Coulter per determinare la concentrazione stock.
19. Preparare un Mix microsfere Maestro diluendo ogni perla ad una concentrazione finale di 100 perline / mL in TE buffer. Piscina accoppiato perline corrispondente al complesso desiderata del test (ad esempio per un 10-plex test, mix 10 perle diverse unita ad una concentrazione finale di 100/μl di ogni perla).
20. Conservare il Mix microsfere Maestro a 4 ° C al buio. L'impasto può essere conservato per mesi se mantenuto in queste condizioni.

2. Chaperonine 60 universale destinazione (cpn60 UT) amplicone produzione e generazione di singoli filamenti.

1. Generare la reazione a catena della polimerasi (PCR) del prodotto per ogni campione. Includere le fosforotioato-e impostare fondo biotina modificato 5 '(Tabella 1). Vedere la Tabella 3 per i volumi per miscelare e concentrazioni.
2. Subito dopo la PCR è completa, aggiungete 2 microlitri (20 unità) di T7 exonuclease a ciascuna provetta PCR (PCR buffer sarà sufficiente per la reazione T7). Incubare la reazione a temperatura ambiente (~ 22-25 ° C) per 40 minuti.
3. Al termine di questa incubazione, aggiungere 12,5 ml di 0,5 M etilene diammina (EDTA) pH 8,0 e mescolare. Questo dà un totale di ~ 64.5μl del singolo filamento prodotto della PCR.

3. Ibridazione di singolo filamento prodotto PCR di oligonucleotidi ad accoppiamento perle di polistirene.

1. Preriscaldare lo strumento a 60 ° C per mantenere la temperatura di ibridazione durante l'analisi. Accendere il riscaldatore piattaforma utilizzando il software dello strumento e assicurarsi di utilizzare il blocco di riscaldamento in ottone che si inserisce la PCR-stile piatto che contiene la miscela ibridato tallone.
2. Risospendere microsfere Master Mix (step 1,20) con una pipetta, una quantità appropriata dispensare in una provetta Eppendorf, tappo del tubo, e sonicare in un sonicatore bagnomaria per 2 minuti. In alternativa, per garantire la coerenza assoluta nel tallone resuspeESPANSIONE, la master mix microsfere possono essere risospese vortex e pipettaggio, poi sonicazione come sopra, poi dispensare la quantità desiderata in un tubo di polipropilene Eppendorf.
3. Dispensare 17 ml di prodotto a singolo filamento PCR (punto 2.2) nei rispettivi pozzetti, di un basso profilo da 96 pozzetti Pozzetto piastra PCR (Tabella 2). Aggiungere 33 ml di risospeso, miscela sonciated perlina in ogni pozzetto. Coprire con coperchio in silicone (Tabella 2) e toccare delicatamente.
4. Mettere la piastra nel termociclatore con un programma di: 95 ° C per 5 min, 60 ° C per 10 min, 60 ° C attesa, 60 ° C per 5 minuti, fine. Avviare il programma.
5. Fai fresca streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) soluzione; avrete bisogno di 25 microlitri per bene (fare diversi pozzi extra). Fai la SA-PE soluzione diluendo magazzino SA-PE (1 mg / ml) 1:50 a 20 mcg / ml con 1x cloruro tetrametilammonio (TMAC) buffer (3 M TMAC; Sarkosyl 0,1%; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 4 mM EDTA, pH 8,0).
6. Quando il termociclatore arriva al 60 ° tenere passaggio C,aprire il coperchio, togliere il coperchio di silicone e aggiungere SA-PE soluzione direttamente a ciascun bene (non prendere la piastra dal termociclatore). Riposizionare il coperchio di silicone, chiudere il coperchio termociclatore e riprendere il programma.
7. Quando il programma è completo, prendere il piatto fuori e velocemente trasferire alla macchina Bioplex da leggere. Piastra deve essere letta entro 10 minuti. Leggi a 60 ° C, in modo che il Bioplex preriscaldata a questa temperatura. Essere certi che l'altezza della sonda è stato adattato per ospitare la piastra utilizzato, come descritto nel manuale d'uso per lo strumento utilizzato.
8. Per un accurato tallone e la rilevazione del segnale, le impostazioni cancello sulla Bioplex deve essere impostato in base al tipo di microsfere in uso. Perle di polistirene BioRad richiedono un'impostazione cancello di 4,335-10,000 mentre microsfere magnetiche richiedono un ambiente di 5.000-25.000. C'è anche la possibilità di utilizzare la piastra utilizzando l'impostazione Alta PMT che aumenta il valore di guadagno reporter. Ciò che possoncrease l'intensità dei segnali inferiore tuttavia è importante includere un controllo appropriato negativo come segnale di fondo sarà anche aumentata.

4. Rappresentante dei risultati:

Uno dei nostri obiettivi nello sviluppo e attuazione del presente saggio è stato quello di renderlo il più semplice e snella possibile. Abbiamo quindi ottimizzato la critica post-amplificazione fasi, compreso il tempo di trattamento esonucleasi T7 e il tempo di ibridazione al fine di sviluppare un metodo che può essere completato in un arco di tempo ragionevole. Come mostrato nella Figura 2A, il trattamento T7 dell'amplicone è essenziale per la generazione del segnale, come la maggior parte delle sonde avevano poco o nessun segnale con breve o nessun trattamento T7. Il segnale aumenta in modo lineare fino a circa 40 minuti, momento in cui l'aumento del segnale di rallentamento. Nessun degrado del segnale è stata osservata anche a 2 ore di tempo di trattamento T7, indicando che la modifica fosforotioati dei primer è altamente efficace nel prevenire Targedegrado filone t come descritto ^15. Abbiamo scelto 40 minuti per tempo di trattamento T7 ridurre al minimo il tempo complessivo di protocollo, ma è chiaro dalla Figura 2A che il trattamento T7 può andare avanti per molto più tempo. Abbiamo anche determinato l'effetto del tempo sulla ibridazione generazione del segnale (Figura 2B) ed ha trovato che 10 minuti sono stati sufficienti per il massimo del segnale, in quanto non ulteriore aumento del segnale è stata osservata anche dopo 4 ore di ibridazione. Quindi, un passo ibridazione 10 minuti è stato scelto, ancora una volta per minimizzare il tempo complessivo di analisi. Con questi risultati in mente, e con tecniche rapide di estrazione del DNA come InstaGene (Bio-Rad), l'analisi globale, compresa l'estrazione del DNA, PCR, e analisi Luminex può essere completato in 4-5 ore.

Su una nota di cautela, il livello di aggregazione delle perle di polistirene durante una corsa o Luminex Bioplex può avere un impatto importante sulla efficacia del test. Il software Bioplex mostrerà il livello di aggregazione tallone, che si verifica quandopiù di una perla viene rilevato nel percorso laser e comporta l'esclusione del segnale di ibridazione dal aggregato. Apparente aggregazione tallone può anche essere causato da qualsiasi materiale particolato che non è la dimensione corretta per un unico tallone, e può anche essere causato da bolle d'aria. In uno di questi eventi, il segnale proveniente dal aggregato perlina, bolla d'aria, o particella viene scartato. Nella maggior parte dei casi, troviamo che l'aggregazione tallone è minimo (figura 3A) e il livello mirato di 100 eventi contare per ogni perlina è facilmente realizzabile. Occasionalmente, tuttavia, le perle mostrano un moderato (Figura 3B) o grave (Figura 3C) livello di aggregazione. In questi casi, poiché la maggior parte dei dati viene scartato, lo strumento potrebbe avere problemi a raggiungere 100 eventi per ogni tipo di perla e il risultato può essere discutibile. Il passo sonicazione (passo 3.2) ha lo scopo di minimizzare l'aggregazione tallone. Inoltre, l'archiviazione le perle come un mix diluire maestro microsfere (punto 1.20) può aiutare. Abbiamo notato che TMAC escludendo dalla hybritampone dization - aggiungerla alla SA-PE diluente invece (passo 3.5) - aiuta a minimizzare l'aggregazione tallone. Inoltre, mentre non abbiamo testato questo, le sfere magnetiche più recenti disponibili da Luminex o BioRad sono pensati per visualizzare meno di una tendenza ad aggregarsi.

I risultati dell'applicazione di un 5-complesso serie Luminex targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, e L. gasseri con corrispondente Gram strisci colorati tampone vaginale sono mostrati in figura 4. Questi campioni sono stati prelevati da un singolo individuo in momenti diversi. Al tempo 0, l'individuo è stato diagnosticato un BV sulla base di colorazione di Gram (Figura 4A) ed i risultati Luminex da questo stesso campione (Figura 4B) mostrano che degli organismi rappresentati nella matrice, G. vaginalis è più diffusa, mentre A. vaginae e L. iners sono stati positivi. Nove giorni dopo, l'individuo era ancora BV positivo e il signal per G. vaginalis sono notevolmente aumentate, mentre A. vaginae e L. iners erano ancora positivi. È importante sottolineare che, dopo questo tempo l'individuo ha cominciato a transizione verso un microbiota normale come bacilli Gram positivi è diventato rilevabile nella strisci (Figura 4A) mentre il segnale di G. vaginalis svaniva ed il segnale per L. iners aumentato (Figura 4B). Con la nostra definizione originale di BV con questo metodo (campioni positivi per G. vaginalis e / o A. vaginae stati considerati positivi BV) ^13, questo individuo era BV positivo a tutti i tempi, anche se la colorazione di Gram non è riuscito a rilevare G. vaginalis in questi ultimi due punti del tempo. Con il metodo descritto qui Luminex, le tendenze possono essere facilmente rispetto al sequenziamento metodi basati, ed i risultati del test confermano Luminex tipicamente colorazione di Gram ^13, fornendo ulteriori informazioni sull'identità organismo e abbondanza.

Figura 1. Schema del protocollo Luminex per la determinazione del profilo microbiota di un campione clinico complesso o ambientali. Il protocollo inizia con il DNA modello che è stato estratto dal campione di interesse. (1) Generare prodotto di PCR da DNA stampo utilizzando filo-specifico biotinilato, fosforotioato modificati cpn60 UT primer PCR accoppiata con non modificato cpn60 UT primer PCR (Tabella 1), (2) Questo genera un pool di PCR prodotto che rappresenta il microbiota con la biotina- fosforotioato modifica su un filo, (3) Digest double-stranded prodotto PCR con esonucleasi T7, che non può degradare la fosforotioato modificato filo e genera quindi a singolo filamento di DNA che si modifica al 5 'con biotina, (4) Coppia perle di polistirene a specie-specifico cpn60 sonde UT - ogni perla ha un indirizzo univoco spettrale (indicata dal colore perla) che idistinguibili dal Luminex o Bio-Plex strumento s; (5) ibridare il singolo filamento prodotto di PCR generato dal campione di interesse per il suite di specie-specifico oligonucleotide accoppiato perle; (6) Aggiungere streptavidina-ficoeritrina coniugato che si lega alla il biotinilato a singolo filamento prodotto di PCR e agisce come un indicatore di ibridazione; (7) Determinare l'indirizzo spettrale (tallone d'identità) e l'intensità del segnale di ibridazione con un Luminex o Bio-Plex strumento. Almeno 100 perline vengono conteggiati per ciascuna identità tallone e l'intensità media di fluorescenza (MFI) del segnale ficoeritrina viene segnalato come l'uscita. Fino a 100 diversi tipi cordone possono essere valutate contemporaneamente, ma un saggio che mostra la discriminazione di tre tipi tallone è illustrata. (8) Quando il MFI di PCR replica generata dallo stesso campione è significativamente maggiore rispetto al controllo negativo per un dato tallone (una coda studente t-test, p <0,05), il campione è considerato positivo per tale organismo.

Figura 2. Ottimizzazione dei parametri di test Luminex. Cinque diverse sonde mirati per anaerobius Peptostreptococcus sono stati utilizzati con ampliconi generati da un modello misto composto plasmidi contenenti il clonato cpn60 UT di 20 batteri noti per essere associati con la vagina, tra cui P. anaerobius. (A). Effetto del tempo di trattamento esonucleasi T7. Il protocollo sopra descritto è stato seguito, ma il tempo di trattamento con esonucleasi T7 è stata variata prima di ibridazione e l'intensità media di fluorescenza (MFI) è stata determinata per tutte le sonde. (B). Effetto del tempo di ibridazione. Il protocollo sopra descritto è stato seguito con una varietà di tempi ibridazione. Gli stessi set di sonde sono state usate con un amplicon generato utilizzando lo stesso modello come in A e l'intensità media di fluorescenza (MFI) è stata determinata per tutte le sonde.

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Figura 3. Determinazione di aggregazione tallone utilizzando il software Bioplex. Tre esempi sono dati di piste Bioplex in cui il livello del tallone aggregazione è (A), accettabile (5%), (B), borderline (50%) e (C) inaccettabili (80%).

Figura 4. Applicazione di un 5-complesso serie Luminex alla diagnosi BV sequenziale in campioni prelevati da uno stesso individuo. (A). Gram-vetrini colorati che mostrano il tradizionale diagnostici utilizzati per valutare ogni campione di BV. (B). Applicazione di un 5-complesso serie Luminex preparata ed eseguita come descritto in questo protocollo per gli stessi quattro esemplari mostrati in (A). Obiettivi batterica IFM cui segnale è stato significativamente positivo per la nostra definizione (una coda studente t-test, p <0,05) sono contrassegnati da un asterisco (*).

Discussion

La specificità di generazione del segnale è di importanza critica, si deve essere sicuri che il segnale osservato rispecchia in pieno la rilevazione degli ampliconi generati da tale organismo. Software come PrimerPlex (Premier Biosoft) può aiutare a progettare delle sonde che ibridano in modo efficiente, ma può o non può cross-ibridare a specie non bersaglio. Quando universale primer PCR sono utilizzati come descritto in questo protocollo, è importante tenere a mente che l'ha generato amplicone rappresenta tutti gli organismi presenti nel campione. E 'importante, quindi, di analizzare le sonde potenziale per la possibilità di cross-ibridazione confrontando le sequenze suggerito dal software di progettazione sonda al cpnDB, un database di sequenze cpn60 UT ^16; sonde corrispondenti organismi più sono da evitare, se possibile, . Inoltre, quando le sonde potenzialmente specifiche sono identificati, abbiamo adottato un approccio per sondare la convalida in cui un complesso, artificiale template è preparato corrispondente alla clonato cpn60 UT di un certo numero di organismi associati al microbiota di interesse ^13. Amplicone è quindi generato dal completo "pannello misto", tra cui il modello bersaglio, e il segnale viene paragonato a quello generato da un secondo modello comprende il pannello misto che non contiene l'organismo bersaglio cpn60 UT. Sonde che generano un elevato rapporto segnale-rumore (dove il segnale viene generato dal pannello completo e il rumore è generato dal pannello senza il modello di destinazione) sono selezionati per essere inclusi nel test finale. Abbiamo analizzato tipicamente 4-5 sonde possibili per ogni organismo bersaglio prima di utilizzarlo per l'inclusione nella serie finale di Luminex.

La definizione di un risultato positivo è un problema da considerare. Abbiamo scoperto che diverse sonde sono intrinsecamente diverse segnale-rumore rapporto, così abbiamo deciso su un approccio in cui un risultato positivo è definia cura di un test molto semplice statistica: la t di Student-test (una coda). Un risultato positivo è definito confrontando il MFI del campione per il controllo "non modello", e quando la IFM è significativamente più alto rispetto al controllo con p <0,05, il risultato è considerato positivo per tale organismo. Normalmente due ampliconi vengono generati in maniera indipendente ciascuna testata in duplicato. Anche se la PCR e passi esonucleasi T7 creare circa 64,5 ml di prodotto a singolo filamento PCR (passo 2,3) e solo 17 ml di questo viene utilizzato per l'ibridazione (punto 3.2), sufficiente per 3 saggi di ibridazione, di solito analizzare duplicati da due amplificazioni a dare una replicare inerente tecnico senza l'utilizzo di un numero eccessivo di pozzi.

Un aspetto di questo test che abbiamo studiato è la sua natura semi-quantitativa. Il segnale IFM da una sonda dato si correla bene alla qPCR determinato abbondanza di un dato organismo (coefficiente di correlazione di Spearman & rho; = 0,4686, p <0.0001) ^13, ma la gamma dinamica è limitata; il segnale tende a saturare a livelli di target più alto organismo, come previsto dal amplicone viene analizzato dopo punto finale PCR di 40 cicli. Perché è semi-quantitativa, le tendenze in abbondanza nell'organismo può essere monitorato e modelli osservati (tenendo il caveat in mente per quanto riguarda la saturazione del segnale alle alte abbondanze). Per esempio, la Figura 4 mostra un profilo del microbiota vaginale di un individuo nel corso del tempo come si cambia da BV alla normalità. Quando questo accade, il segnale corrispondente a G. vaginalis (un organismo associato ^BV-17) aumenta e poi diminuisce, mentre nel corso del tempo il monitoraggio del segnale per L. iners aumenta. Colorazione di Gram corrispondente, l'attuale "gold standard" per la diagnosi BV, mostrano un modello in cui i bacilli Gram-positivi sono inizialmente assenti, ma sono rilevabili nei punti più tardi. Il metodo di Luminex sia identifica gli organismi presenti nel campione e dà some informazioni sulla loro abbondanze relative. Questo tipo di informazioni potrebbe essere utilizzato per monitorare campioni di ogni tipo per le tendenze indesiderabili nelle abbondanze di organismi particolari e in grado di fornire tali dati per un gran numero di organismi contemporaneamente.

È importante sottolineare che questo metodo non si limita all'analisi delle caratteristiche del microbiota vaginale e può ragionevolmente essere applicato a qualsiasi ambiente in cui l'individuazione e la quantificazione parziale di una serie di organismi bersaglio è auspicabile. Quando si applica il metodo in altri ambienti, è importante considerare la possibilità di inibizione della PCR che si verificano, come gli inibitori della PCR comunemente co-purificano con il DNA da molti ambienti ^18. Dove l'inibizione della PCR è un problema, il campione può essere diluito o ulteriormente purificato al fine di generare segnale sufficiente per questo test.