膜片钳电容测量和Ca ^{2 +}单神经末梢成像在视网膜切片

Summary

在这里，我们描述了一个协议，准备琼脂嵌入式适合电和Ca2 +成像视网膜切片。这种方法允许一个研究使用录音单突触前神经末梢的直接膜片钳视网膜微型带状型突触。

Abstract

发现视觉刺激，并转达了专门的神经元在脊椎动物视网膜的光线强度和频率的变化在很宽的动态范围。两个班的视网膜神经细胞，感光细胞和双极细胞，使用色带类型的活动区，从而使长的时间周期，持续和高吞吐量的神经递质的释放。型混合双极细胞终端（MB）在金鱼视网膜，从而去极化光刺激和接收混合杆和锥感光输入，适合的带状型突触都因他们的大尺寸（〜10-12的研究微米直径）和他们的许多横向和互惠的无长突细胞树突的突触联系。 MB双极细胞在金鱼视网膜切片膜片钳技术终端直接访问允许测量突触前的Ca ^{2 +}电流，膜电容的变化，和互惠的反馈抑制GABA介导的突触<分> A和GABA _彗星受体表达上的终端。突触前膜电容测量胞吐允许一个短期的可塑性研究的兴奋性神经递质^的释放14,15。此外，短期和长期的无长突细胞的抑制性神经递质释放的可塑性也可以^抵达的21 MB终端的相互反馈抑制录音进行调查。 GABA能无长突细胞的相互反馈抑制经过短时间的时间（例如〜10秒），通过GABA的小泡池^枯竭 11双脉冲抑郁症。在视网膜内丛状层视网膜微型突触动力学因此可以直接研究。

大脑切片技术引入超过40年前，但仍然是非常有用的神经元的电性能，无论是在单细胞胞体，树突或轴突单，调查，和Microcircuit突触水平^19。组织太小，无法直接粘到切片室往往是先嵌入在琼脂（或放置到一个滤纸），然后切片^{20，23，18，9。}在这段视频中，我们采用预嵌入琼脂技术，使用金鱼视网膜。在金鱼视网膜片的巨型双极细胞终端axotomized（轴突切割）在切片过程中。这允许我们分离单个突触前神经末梢输入，录音排除，因为从axotomized终端的信号从胞体树突状车厢。另外，也可以从完整的MB双极细胞记录，从没有减少在切片过程中的轴突连接到终端记录。总体而言，这个实验性的协议的使用将有助于在视网膜突触生理学，微电路功能分析，带状突触的突触传递的研究。

Protocol

1。外部和内部的解决方案

1. 准备从10倍原液切片溶液（低钙）和每天添加_{2，氯化钙} ，氯化镁和D -葡萄糖。最后1X解决方案，包括（毫米）：119氯化钠，氯化钾2.5，3.2，0.25 MgCl _2的氯化钙，12个D -葡萄糖，0.2 L -抗坏血酸，12 HEPES 。设置pH值至7.4（用NaOH），并调节渗透压260 mOsm（使用H _{2 O}和10倍原液） 。
2. 称取3％的低胶凝温度琼脂（琼脂糖类型VII - A，A0701，Sigma公司;雷基，2001年）和切片的解决方案组合。热琼脂溶液，在微波1-2分钟，或直到它完全溶解，在水浴（30-33℃）孵化琼脂，以防止快速凝固（凝胶化转变温度：26 ± 2 ° C）
3. 准备录制解决方案（正常钙）从10倍原液，每天_添加2，氯化钙，氯化镁和D -葡萄糖。最后1X解决方案consisTS（毫米）：100氯化钠，2.5氯化钾，氯化镁₂ 1，25碳酸氢钠₃ 0.2 2.5 L -抗坏血酸， _氯化钙 ，12 D -葡萄糖。冒泡的解决方案，在_{95％Ø 2} / 5％的_CO 2（carbogen）5-10分钟后，设置pH值7.4（用NaOH），并调整渗透压260 mOsm（H _{2 O}和10倍原液）。
4. 等分（1毫升）的内部移液器解决方案，提前做好准备，并储存在冷冻室（-20℃）。两个内部移液器解决方案通常用于隔离双极细胞钙电流（毫米）：
   1. 40 CS -葡萄糖，CSCL，60 10四乙基胺（TEA）- CL，28 HEPES，镁ATP钠GTP，EGTA 2 3。调整pH值至7.2（与CsOH）和渗透压设置为250 mOsm。这种高氯内部解决方案通常会提供一个双极细胞静息膜电位为-60 mV的低串联电阻录音（更好的电压钳条件）和较大的抑制性突触后电流（iPS细胞）。
   2. 95 CS -葡萄糖，10茶- CL，25 HEPES，3毫克，ATP，0.5钠GTP，EGTA 0.5。调整pH值至7.2（用CsOH），并设置渗透压250 mOsm ^22。这种低EGTA的内部解决方案通常会导致去极化步脉冲引起较高的膜电容的变化，从而使小泡池枯竭和短期的经济大萧条的研究。

2。膜片钳吸管电极

1. 准备厚壁（外直径1.5毫米），高硼硅玻璃（1B150F - 4;世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州）和拉补丁移液器使用垂直拉马（Narishige，PP830，东京，日本）。打开提示补丁录音解决方案移液器电阻7-8MΩ的移液器充满内部液＃1。
2. 大衣补丁吸管均匀，从尖轴，达到吸管人，牙科用蜡，（CAVEX，西切斯特，PA）的水平。这将最大限度地减少吸管电容和电气噪声，并启用更准确，低噪音电容测量。吸管低电容也有助于电子EPC - 9（或EPC - 10）膜片钳放大器的C快（快速电容）的补偿。

3。琼脂包埋的视网膜切片的制备

1. 选择金鱼（ 鲫鱼 ; 8-16厘米），在一个黑暗的房间在暗适应30分钟的覆盖斗和地点。麻醉后，安​​乐死的镇静剂金鱼快速断头和脊髓和脑干双pithing。然后取出弯尖的剪刀和弯曲的尖镊子的眼睛。在俄勒冈卫生科学大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）已经批准了这些程序。
2. Hemisect每只眼睛由围绕眼睛的前面，均匀地切割剪刀弹簧（15003-08，精细的科学工具;发起削减剪刀提示穿刺），并放置在冷冻切片的解决方案（低钙）的眼罩。如果necessary，取出镊子镜头（镜头通常会分离与眼睛的前面）。取出的视网膜色素上皮细胞使用的是一双45 °角细尖镊子（11251-35，精细科学的工具）视网膜剥离远离眼罩，进展缓慢周围360 °连接。切断或削减或者罚款钳或弹簧剪刀视神经。轻轻取出视网膜结合的角度的精尖钳和修改后的巴斯德吸管或移液管（大尖）应用的吸。使用角度的精尖钳取出视网膜色素上皮剩余。表面的清洁和健康的视网膜的，应该出现暗，光滑，红色。对于所有深色的色素上皮细胞的完整切除暗适应1 ^小时 （8，1992）在视网膜上。
3. 治疗孤立视网膜〜0.03％（WT /卷;片〜0.36 mg / ml的1X解决方案）;在室温15-30分钟的透明质酸（H6254， ^西格玛 3 ）清除玻璃体的温度（20-23℃）。在此潜伏期，你可以准备冰冷片解决方案。
4. 通过消除与刀片的一小部分（Personna，一把双刃剑，用70％乙醇和H ₂ O清洗）连接到弯曲的边缘剪下一块长方形的视网膜（〜2 × 2毫米，含视网膜全层） 1毫升的塑料注射器的身体，和转移视网膜一块充满琼脂溶液（1.2）准备一个小容器。尽量减少周围视网膜的解决方案，因为它是放置到液体培养基。直接浸泡在冰冷的片解决方案（准备（3.3）），以巩固琼脂^{20，18，9。}我们用一个小的，手工制作的容器。简单地说，一个小圆管（Fisherbrand，聚乙烯样品瓶2.5毫升，03 - 338 - 1B）在两端被切断，并用封口膜（PM - 996，佩希内塑料包装）修补密封。
5. 固体琼脂块切成1x1x1厘米的立方体包含一块长方形的视网膜。
6. 块转移到片室和胶切片板的表面。片室在冷冻室（-20℃）预冷。 200-250微米厚的薄片，在冰冷的片解决方案使用一个Vibratome切片机（VT1000S或VT 1200S，徕卡），切成块。可以得到总共5至10片，这是可行的约5至6小时。
7. 切片传输到录音室。将一个网格片上粘一个U形的铂^金帧19的尼龙线，并连续灌注与_95％O 2 / _5％CO 2（carbogen冒泡的录音解决方案（1-2毫升每分钟的速度） ）。

故障排除：

如果视网膜一块镶嵌在琼脂块分离或在切片的琼脂，可以增加层厚200微米至300微米20微米的增量。此外，尽量减少周围视网膜的解决方案，因为它是转移和放置到液体培养基卷“Kimwipe”纸尖吸干多余的解决方案。为了避免这个问题的另一种方法是减少最初放在琼脂视网膜片的大小。由于玻璃体禁止琼脂完全附着在视网膜一块，可能有必要做出新的透明质酸或调整孵化时间（步骤（3.3））。

4。在视网膜切片的双极细胞的突触终端的识别

1. 在直立显微镜（如BX51WI，奥林巴斯）下视网膜切片的位置。我们认为与红外微分干涉对比（IR - DIC的）通过一个60倍的水浸泡的目的，奥林巴斯（NA 0.90）和CCD相机（XC - 75，索尼）光学视网膜切片。 CCD相机的输出被发送到对比度增强的可视化模拟的索尼13“双语法例咨询委员会前一个摄像机控制器（C2400，滨松）K和黑白显示器。显微镜是装在一个XY平移台，录音室是放置在一个固定的阶段^14。
2. 完整和axotomized（轴突切）双极细胞终端，可以通过它们的大小，形状，切片（ 图1）中的位置确定。杰出Axotomized和完整的终端也可以通过检查其库容的瞬态电流衰减时间（单指数与双指数衰减，分别） ^和 Ca ^{2 +}电流（图 ^{2，12，14，15）} 。 MB码头位于sublamina b最近端层（ON型层;相邻的神经节细胞层）在金鱼视网膜内丛状层。 MB终端，与他们的沉闷的表面和平面外观，可以很容易地区别于节和流离失所的无长突胞体，从而出现相光明和球形。此外，MB终端的优势是覆盖高密度的突触联系，并显得粗糙和不规则的，比较干净的表面光滑，神经节和无长突细胞（图1A - C ）。 Axotomized MB终端出现圆形，近圆形（ 图1c），而完整的终端出现椭圆形和延伸，往往带有捏指着走向内心的视网膜核层（图1A，B）结束。
3. 损坏或不健康的终端往往显得肿胀，表面上显示几个小颗粒结构。它可能会获得这些终端GΩ的印章，但他们可能破裂后不久突破。其他不健康的终端迹象包括一个中空的外观，对比度和/或亮度周围切片，有时在片表面的位置相同。这是健康端子切片中的深（优点：更完整的突触电路）记录和片表面附近（ADVantage：更快地访问灌注药物在外部的解决方案;更容易密封）。

5。电生理记录和Ca ^{2 +}成像

1. 使用一个0.2微米的过滤嘴（NALGENE）的注射器，填补内部解决方案的水平1-2厘米移液器背面的玻璃修补吸管。取出后的提示气泡，保护持有人的吸管，申请正压（1.2-1.6 PSI），并朝着目标使用一个显微的终端（MPC - 200，萨特仪器）。同时通过片尖向下，在横向席卷方向移动吸管，以确保切片是不拉用刀尖。
2. 移动终端周围的吸头，清洁膜表面。向下推终端创建一个酒窝（缩进），并释放正压边缘的一角。如果GΩ的密封并不构成立即的，适用于轻微的负压力。 一个GΩ的印章后，切换到EPC - 9膜片钳放大器的细胞记录模式，并保持电位变化到-60或-70毫伏。应用的C -快速（快速电容）校正，等待为5-10GΩ的稳定之间的密封，然后破裂的犀利，温柔的吸口应用，建立了全细胞记录配置的膜。如果整个单元配置已正确建立，将串联电阻之间14-30MΩ。输入电阻将完整的终端和¹⁴ axotomized端子1-3GΩ的200-500MΩ。
3. 观察电容电流瞬变（ 图2A和2C），区分完整和axotomized双极细胞终端。完整和axotomized MB终端有一个基线膜9-16 pF的电容和3-8 pF的分别。
4. 申请一个200毫秒从-70至0 mV至axotomized MB终端电压钳一步。这将使大（〜200-600 PA），隔离外来的Ca ^{2 +}激活电流电压依赖性L -型钙²开放⁺通道（ 图2b）的直接测量。与此同时，一个是能够监控突触囊泡的胞吐作用所造成的电容跳，并迅速，pH介导的^抑制的 Ca 2 +电流^如下胞吐15，和GABA能相互反馈抑制 （ ^图 3C; 22）。如果一个补丁一个完整的MB双极细胞终端的结果将显示在图2C和2D。没有明显的^{Ca 2 +}电流是因为大电流由于“泄漏”差距MB的双极细胞树突的交界处耦合观察。
5. 膜电容的变化，可以使用“正弦+直流^”6时间分辨的膜电容测量方法，从保持电位-70 mV的0 mV时的一个步骤去极化诱发。膜电容的跳跃表明突触囊泡与质膜融合。 2 kHz的正弦电压钳位命令（30 mV峰 - 峰）添加到-70 mV的电位。记录目前是由EPC - 9膜片钳放大器的软件仿真的两个正交相位角分析一个锁相放大器（HEKA，Lambrecht，德国）。在图2d，高频率（2 kHz）的正弦刺激范围进行分析，以终端的神经末梢和轴突，其中有一个基线电容厘米〜6.8 PF的膜电容的完整的终端。双极细胞的胞体和树突膜，从而过滤掉高频电压钳^正弦波 13 。
6. 对Ca ^{2 +}成像实验，彻底混合的Ca ^{2 +}敏感的荧光染料与内部的补丁吸管解决方案（如俄勒冈绿488 BAPTA - 1（100-200μM，O - 6806，Invitrogen公司））和重复的协议50.1到5.5。这将允许一个结合荧光成像和电生理记录。例如，它可以形象的Ca ^{2 +}的瞬态一个200 ms的步长从-70至0 MV MB终端（图3A，B）在小telodendria附属物。我们整合了我们直立的奥林巴斯显微镜，旋转盘激光共聚焦显微镜系统（CSU - X1，横河电机）。共聚焦显微镜使用488 nm和561 nm激光线，是由一个声光可调谐滤波器调制。数据采集​​使用Slidebook软件（3I;智能成像仪器）。对于使用金鱼视网膜神经细胞钙成像技术的进一步详细信息，请^{参阅24，17，3} 。

故障排除：

如果一个人经常未能建立一个全细胞配置，甚至形成一个稳定的GΩ的印章后，它可能是有益的，以减少使用负压穿刺终端我mbrane。这也可能是建立全细胞配置最佳的吸气压力作为膜曲率（SOMA>终端）的功能变化的情况下。它也可以使用ZAP协议（幅度：400 mV时，持续时间：100微秒），单独或结合一个尖脉冲负压进入全细胞配置。我们已经找到了ZAP协议一起使用时，在超过12MΩ浴电阻一个枪头，要突破特别有用。

6。代表性的成果

图1。MB双极终端在金鱼视网膜片细胞的鉴定。 （AC）IR - DIC的MB双极细胞终端的图像。我们可以找出可能axotomized（轴突切割）和完整​​的IR - DIC的形象终端。 axotomized终端出现圆形和圆形， 在 C所示一个完整的终端，而更可能出现椭圆形，在A和 B所示。这种分类可以确认瞬态电容测量（见图2），或由染料充填法（D - F） 。红色箭头表示在A和 B的交点之间的轴突和轴突终端的完整的终端的位置。红色虚线表示MB双极细胞码头的轮廓。 （DF）。 MB双极终端与一个完整的轴突（D），一个部分切断的轴突（E），或完全拆除的轴突（F）细胞荧光图像。 Alexa的555（A20501MP Invitrogen公司）荧光染料充满了内部解决方案之前录制。视网膜切片膜片钳记录后，立即被转移到4％（WT /卷）多聚甲醛磷酸盐缓冲液（P6148，Sigma公司）（70013，GIBCO公司）孵育30分钟。片安装到Superfrost幻灯片（Fisher Scientific这）抗衰落代理（Biomeda公司）在水溶液中的安装介质。 Alexa的555 MB双极细胞终端被视为与555 nm激光线（红色）使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM的710卡尔蔡司）一个40倍的水浸泡目标。注意telodendria从轴突终末（蓝色箭头）凸出的小附属物的存在。比例尺显示10微米（A - F）。 INL：内核层，彩光：内网状层，GCL：神经节细胞层。

图2。axotomized和完整MB双极细胞终端的电气性能。 （A，C）的瞬态电流响应从-60 mV的控股潜力-70毫伏的电压钳步超极化激活。短路电流-10 mV的电压钳一步可能会导致：1）单一快速指数电流衰减，高输入电阻在-70毫伏（axotomized终端指示;面板），或2）与低输入阻抗的双指数-70毫伏（指示性的衰变一个完整的终端; C组，另见^{12，14，15）。} （B，D）的Ca ^{2 +}电流和膜电容跳一步的去极化从-70至0 mV时引起。时间分辨的膜电容测量使用一个2 kHz的正弦波叠加刺激休息控股潜力-70 ^毫伏 6 。红色迹线是电容数据点的平均值。请注意，在图2B和2D电容跳都等于200 FF。

图3。直接测量的Ca ^{2 +}成像信号，胞吐作用，并在M的抑制反馈b双极细胞终端。 （ 一 ）瞬态崛起中的Ca ^{2 +}浓度在一个MB终端telodendria由电压钳一步的去极化从-70至0 mV时为200毫秒（箭头）被激活。俄勒冈州绿488 BAPTA - 1（100μM）， ^钙离子指 ​​示剂，包括在补丁吸管。 （ 二 ）通讯MB telodendria（红色虚线表示有兴趣的地区）的荧光图像。 （三）短期突触抑郁症，神经递质的释放（胞吐） 。一双20 ms的去极化到0 MV（上跟踪; 200毫秒脉冲间间隔）诱发的Ca ^{2 +}电流（中间曲线）和膜电容（低跟踪）。箭头表示exocytosed质子的作用^的 Ca ^{2 +}电流也从邻近的无长突^{细胞15，21} GABA能相互反馈抑制。请注意，质子介导抑制的^{Ca 2 +}电流也GAB目前，仅在第一次去极化反应，这也有一个电容跳由于突触囊泡的胞吐Aergic互惠反馈抑制。

Discussion

一个关键和艰难的一步，在我们的协议转让的视网膜上成的琼脂溶液（3.4协议） 。这是必要的，小心地取出玻璃体和视网膜片残余片解决方案，传输不失真或弯曲。为了做到这一点，我们使用了一个尖弯曲90 °角，沿直角尖镊子（11251-35，精细科学的工具），位置视网膜的小抹刀（21 - 401 - 25B，Fisherbrand）片解决方案的整个传输过程中的一块。仔细涂抹表面与一个折叠或卷起Kimwipes（金佰利）的角落，可去除残留在视网膜片和刮刀片的解决方案。

另一种常见的方式准备横向视网膜切片滤纸基于^协议 23 。简而言之，整个视网膜的倒片是连接到的微孔过滤器磁盘的矩形件（神经节细胞打下呃，对滤纸感光层朝上），并带有手动垂直“拇指”削​​减到250微米厚的薄片切片机（如Narishige ST - 20）。我们发现，滤纸为基础的协议的优点，包括健康的感光细胞和axotomized完整的MB终端的增长比例。因此，我们使用这个滤纸法引起从单一MB嵌入式终端在视网膜切片的光诱发反应。

在滤纸的协议，我们的琼脂为基础的协议的优点是：1）产生的视网膜切片平坦，甚至，和相对完好的视网膜层之间的清晰的分离，从而使在任何内核层或丛状层视网膜修补细胞，是想要的，和2）免疫组化电生理记录是因为片完整和平面的几何形状和上述（1）项所述的因素，更容易。一个用于记录光响应协议察看朱庇特² s是视网膜神经细胞在琼脂为基础的准备。水平的视网膜切片准备，用琼脂和滤纸技术相结合以前也发表在朱^庇特5。我们建议结合我们自己在观看这些影片，以比较不同的技术。

在脊椎动物视网膜片带状型突触前终端直接访问，使我们能够调查带状型有源区突触传递。它也允许我们直接在视网膜微型突触生理学研究的。这种技术将特别有用配对录音前和突触后信号，突触后的合作伙伴，包括抑制无长突细胞和神经节^{细胞1，16，10}扣球。在大鼠耳蜗内毛细胞和传入神经 ​​树突之间的带状型突触配对录音是可能的， ^已经 7 。钙意马吴MB双极细胞码头已在急性分离细胞和视网膜切片^17，以及在金鱼³无长突细胞。最近的研究表明很大的改进， 在体内和体外optogenetic方法在转基因斑马鱼^视网膜 4 。未来的方向可能会涉及这些转基因技术，再加上电的方法，这将使我们的桥梁体外切片录音，并在体内成像之间的差距，最终导致行为研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low gelling-temperature agar	Sigma-Aldrich	A0701	Agarose type VII-A
Patch pipette	World Precision Instruments, Inc.	1B150F-4	Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller	Narishige International	PP830
Dental wax	Cavex
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
45° angled fine tip forceps	Fine Science Tools	11251-35
Razor blade	Personna Medical Care		Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube	Fisher Scientific	03-338-1B	Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H6254
Vibratome slicer	Leica Microsystems	VT1000S or VT1200S
Upright microscope	Olympus Corporation	BX51WI
60x water-immersion objective	Olympus Corporation	LUMPlanFl	NA 0.90
CCD camera	Sony Corporation	XC-75
Camera controller	Hamamatsu Corp.	C2400
Monitor	Sony Corporation		13” black and white monitor
Syringe filter	Nalge Nunc international		0.2 μm
Micromanipulator	Sutter Instrument Co.	MPC-200
Lock-in amplifier	HEKA Instruments		EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope	Yokogawa	CSU-X1	Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software	Intelligent Imaging Instruments (3i)		Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate buffer solution	GIBCO, by Life Technologies	70013
Superfrost slide	Fisher Scientific		Slide glass
Anti-fading agents	Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710	Imaging of fixed tissue
Spatula	Fisher Scientific	21-401-25B
Manuel vertical slicer	Narishige International	ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1	Invitrogen	O-6806	Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide	Invitrogen	A-20501MP	Fluorescent dye