Summary
Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av agar-embedded retinal skiver som er egnet for elektrofysiologi og Ca2 + bildebehandling. Denne metoden gjør det mulig å studere bånd-type synapser i retinal microcircuits bruke direkte patch-clamp opptak av single presynaptiske nerveterminaler.
Abstract
Visuelle stimuli er oppdaget og formidlet over et bredt dynamisk spekter av lys intensitet og frekvens endres med spesialisert nevroner i virveldyr netthinnen. To klasser av netthinnens nerveceller, fotoreseptorene og bipolare celler, oppnår dette ved hjelp av bånd-type aktive soner, som muliggjør vedvarende og høy gjennomstrømning nevrotransmitter utgivelse over lange tidsperioder. ON-typen blandet bipolar celle (Mb) terminaler i gullfisk netthinnen, som depolarize til lys stimuli og motta blandet stang og kjegle fotoreseptoren innspill, er egnet for studiet av bånd-type synapser både på grunn av sin store størrelse (~ 10-12 mikrometer diameter), og deres tallrike lateral og gjensidige synaptiske forbindelser med amacrine celle dendritter. Direkte tilgang til Mb bipolar celle terminaler i gullfisk retinal skiver med patch-clamp teknikken tillater måling av presynaptisk Ca 2 + strømmer, membran kapasitans endringer, og gjensidig synaptisk feedback-hemming mediert av GABA <sub> A og GABA C reseptorer uttrykt på terminalene. Presynaptisk membran kapasitans målinger av eksocytose tillate en å studere den kortsiktige plastisitet av eksitatoriske nevrotransmitter utgivelsen 14,15. I tillegg kan kortsiktige og langsiktige plastisitet av inhibitoriske nevrotransmitter løslatelse fra amacrine celler også bli etterforsket av innspillinger av gjensidige tilbakemeldinger hemming ankommer Mb terminal 21. Over korte perioder av gangen (f.eks ~ 10 s), gjennomgår gabaergic gjensidig feedback-hemming fra amacrine celler parvise puls depresjon via GABA vesicle bassenget uttømming 11. Den synaptiske dynamikk retinal microcircuits i indre plexiform laget av netthinnen kan dermed være direkte studert.
Hjernen-slice teknikk ble introdusert mer enn 40 år siden, men er fortsatt svært nyttig for etterforskningen av de elektriske egenskapene til nevroner, både på enkelt celle soma, single dendrite eller axon, og microcircuit synaptiske nivå 19. Vev som er for små til å være limt direkte på slicing kammeret er ofte første innebygd i agar (eller plasseres på et filter papir) og deretter skiver 20, 23, 18, 9. I denne videoen, ansetter vi pre-embedding agar teknikk med gullfisk netthinnen. Noen av de gigantiske bipolar celle terminaler i vår skiver av gullfisk netthinnen er axotomized (axon-cut) under kutting prosedyren. Dette gir oss muligheten til å isolere enkelt presynaptisk nerve terminal innganger, fordi opptak fra axotomized terminaler utelukker signalene fra de soma-dendrittiske kupé. Alternativt kan man også ta opp fra intakt Mb bipolare celler, med opptak fra terminaler festet til axoner som ikke har blitt kuttet under kutting prosedyren. Totalt sett vil bruk av denne forsøksprotokollen hjelpemiddel i studier av retinal synaptic fysiologi, microcircuit funksjonell analyse, og synaptisk overføring på bånd synapser.
Protocol
1. Ekstern og intern Solutions
- Forbered slicing løsning (lav kalsium) fra 10x stamløsning og tilsett 2 MgCl, CaCl 2, og D-glukose daglig. Den endelige 1x Løsningen består av (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3.2 2 MgCl, 0,25 CaCl 2, 12 D-glukose, 0,2 L-askorbinsyre, 12 HEPES. Sett pH til 7,4 (med NaOH), og juster osmolaritet til 260 mOsm (med H 2 O og 10x stamløsningen).
- Vei opp 3% lav gelling temperatur agar (agarose type VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) og bland med slicing løsning. Varm agar inneholder løsningen i en mikrobølgeovn i 1-2 min, eller til den oppløses helt, og Inkuber agar i et vannbad (30-33 ° C) for å hindre rask herding (gel overgang temperatur: 26 ± 2 ° C).
- Forbered innspilling løsning (normal kalsium) fra 10x stamløsning og tilsett 2 MgCl, CaCl 2, og D-glukose daglig. Den endelige 1x løsning konsistentts av (i mm): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 2 MgCl, 25 3 NaHCO, 0,2 L-askorbinsyre, 2.5 2 CaCl, 12 D-glukose. Etter boblende løsningen i 95% O 2 / 5% av CO 2 (carbogen) i 5-10 minutter, satt pH til 7,4 (med NaOH), og juster osmolaritet til 260 mOsm (med H 2 O og 10x stamløsningen).
- Alikvoter (1 ml hver) av interne pipette løsninger er forberedt på forhånd og oppbevares i fryser (-20 ° C). To interne pipette løsninger brukes vanligvis til å isolere bipolar celle kalsium strømmer (i mm):
- 40 CsCl, 60 Cs-gluconate, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP, og 2 EGTA. Juster pH til 7,2 (med CsOH) og osmolaritet satt til 250 mOsm. Denne høye klorid intern løsning gir vanligvis lavere seriemotstand opptak (bedre spenning klemme forhold) og større hemmende postsynaptiske strømmer (IPSCs) på en bipolar celle hvilested membran potensial -60 mV.
- 95 Cs-gluconate, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, og 0,5 EGTA. Juster pH til 7,2 (med CsOH) og sette osmolaritet til 250 mOsm 22. Denne lave EGTA interne løsninger fører vanligvis til høyere membran kapasitans endringer oppstår ved depolariserende steg pulser og dermed muliggjør studier av vesicle pool uttømming og kortsiktig depresjon.
2. Patch-clamp pipette elektroder
- Forbered tykkveggede (1,5 mm ytre diameter) borsilikatglass (1B150F-4; verden presisjonsinstrumenter, Sarasota, FL) og trekk plasteret pipettene hjelp av en vertikal avtrekker (Narishige, PP830, Tokyo, Japan). Open-tip patch pipetten motstand i opptak løsninger er 7-8 MΩ når pipetten er fylt med intern pipette løsning # 1.
- Coat den patch-pipetter jevnt, fra spissen til nivået av akselen som når pipetten holderen, med dental voks (Cavex, West Chester, PA). Dette vil minimere pipette kapasitans og elektrisk støy og muliggjøremer nøyaktig og støysvak kapasitans målinger. En lav pipette kapasitans bidrar også til den elektroniske C-rask (rask kapasitans) kompensasjon av EPC-9 (eller EPC-10) patch clamp forsterker.
3. Utarbeidelse av agar-embedded retinal skiver
- Velg en gullfisk (Carassius auratus, 8-16 cm) og plasser i en tildekket bøtte i et mørkt rom i 30 min av mørke tilpasning. Etter anestesi, avlive den bedøvet gullfisk ved rask halshogging og dobbel-pithing i ryggmargen og hjernestammen. Deretter fjerne øynene med buede-tip saks og buet-tip pinsett. Disse prosedyrene er godkjent av det institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Oregon Health & Science University.
- Hemisect hvert øye ved å kutte jevnt rundt fronten av øyet med våren saks (15003-08, Fine Science Tools; initiere kutt ved punktering med saks tips), og plasser eyecups i kjølt slice løsning (lav kalsium). Dersom necessary, fjern linsen med pinsett (objektivet vil vanligvis ta med fronten av øyet). Fjern netthinnen med pigment epitelet festet ved hjelp av et par på 45 ° vinklet tupp fin pinsett (11251-35, Fine Science Tools) å skrelle netthinnen bort fra eyecup, går sakte rundt 360 °. Sever eller kutte synsnerven med enten bot tang eller våren saks. Fjern netthinnen forsiktig med en kombinasjon av vinklet fin spiss tang og sug anvendes fra en modifisert Pasteur pipette eller overføringspipetten (store spissen). Bruk vinklet fin spiss pinsett til å fjerne resten av pigment epitelet festet til netthinnen. Overflaten på renset og sunt netthinnen skal vises mørkt, glatt og rød. For fullstendig fjerning av all mørkt pigment epitelet celler mørk tilpasse netthinnen i 1 time (8, 1992).
- Unn isolert netthinnen med ~ 0,03% (wt / vol; ~ 0,36 mg / ml i 1x slice løsning) Hyaluronidase (3, H6254, Sigma) i 15-30 minutter ved romtemperaturtemperatur (20-23 ° C) for å fjerne glasslegemet. I løpet av denne rugingen, kan du forberede iskald slice løsning.
- Skjær et rektangulært stykke av netthinnen (~ 2x2 mm, som inneholder hele tykkelsen av netthinnen) ved å fjerne den buede kanter med en liten del av barberblad (Personna, tveegget, rengjøres med 70% etanol og H 2 O) festet til kroppen av en 1 ml plast sprøyte, og overføre retinal brikke til en liten beholder fylt med agar løsning (utarbeidet i (1.2)). Prøv å minimere mengden løsning rundt netthinnen som det er plassert i væsken agar. Fordyp direkte i iskaldt slice løsning (utarbeidet i (3.3)) for å stivne i agar 20, 18, 9. Vi bruker en liten, håndlaget container. Kort fortalt, var en liten, sylindrisk tube (Fisherbrand, Polyetylen sample hetteglass 2,5 ml, 03-338-1B) kuttet i begge ender og forseglet med Parafilm (PM-996, Pechiney plast emballasje) patcher.
- Kutt solid agar blokk i en 1x1x1 cm kube inneholder rektangulært stykke netthinnen.
- Overfør blokk til stykket kammer og lim den til overflaten av slicing plate. Stykket kammeret er ferdig avkjølt i fryser (-20 ° C). Skjær blokk i 200-250 mikrometer tykke skiver med en Vibratome slicer (VT1000S eller VT 1200, Leica) i iskaldt slice løsning. Til sammen fem to10 skiver kan oppnås, som er levedyktig i ca 5 til 6 timer.
- Overføring en av skivene til innspillingen kammeret. Plasser et rutenett av nylon tråder limt til en U-formet platina ramme 19 på toppen av stykket, og perfuse kontinuerlig (rate på 1-2 ml per minutt) med opptak Løsningen boblet med 95% O 2 / 5% av CO 2 (carbogen ).
Trouble Shooting:
Hvis retinal stykke innebygd i agar blokken er frittliggende eller kommer ut av agar under kutting, kan man øke skive tykkelse fra 200 mikrometer opp til 300 mikrometer i trinn på 20 mikrometer. Også prøve å minimere mengden av løsning rundt netthinnen som det overføres og plasseres inn i den flytende agar ved å suge opp ekstra løsning med en rullet "Kimwipe" papir spissen. En annen måte å unngå dette problemet er å redusere størrelsen på retinal stykke i utgangspunktet plassert i agar. Fordi glasslegemet forbyr agar fra fullt ut å feste til retinal brikke, kan det være nødvendig å lage fersk Hyaluronidase eller justere inkubasjonstiden (trinn (3.3)).
Fire. Identifikasjon av bipolar celle synaptiske terminalen i en retinal skive
- Plasser retinal slice under oppreist mikroskop (f.eks BX51WI, Olympus). Vi viser retinal skive med infrarød differensial forstyrrelser kontrast (IR-DIC) optikk gjennom en 60x vann-immersion objektiv (NA 0.90, Olympus) og CCD-kamera (XC-75, Sony). Utgangen av CCD kameraet er sendt til et kamera kontroller (C2400, Hamamatsu) for kontrastforbedring før visualisering på en analog Sony 13 "black og hvit skjerm. Mikroskopet er montert på en XY oversettelse stadium, og innspillingen kammeret er plassert på en fast scene 14.
- Finn enten intakt og axotomized (axon-cut) bipolar celle terminaler, som kan identifiseres ved sin størrelse, form og posisjon i slice (Figur 1). Axotomized og intakt terminaler kan også være preget av undersøkelse av deres capacitative forbigående nåværende forfallet ganger (single eksponensiell versus dobbelt-eksponentielle henfall, henholdsvis) og Ca 2 + strømmer (Figur 2, 12, 14, 15). Mb terminaler er lokalisert i de mest proksimale lag sublamina b (ON-type lag; grenser til ganglion celle lag) i den indre plexiform laget av gullfisk netthinnen. Mb terminaler, med sine kjedelig overflate og flatt utseende, kan lett skilles fra ganglion og fordrevne amacrine somas, som vises fase-lys og sfæriske. Videre er kanten av Mb terminaler dekket med et høyttetthet av synaptiske kontakter, og vises grov og uregelmessig når sammenlignet med glatte, rene flater av ganglion og amacrine celler (Figur 1a-c). Axotomized Mb terminaler vises rundt og nær sirkulære (figur 1c), mens intakt terminaler vises elliptiske og strukket, ofte med en klem enden peker mot den indre kjerne laget av retina (Figur 1a, b).
- Skadet eller usunn terminaler ofte ser hovne og vise flere små kornet strukturer på overflaten. Det kan være mulig å få en GΩ segl på disse terminalene, men de er sannsynligvis brudd kort tid etter innbrudd. Andre tegn på usunn terminaler inkluderer en hul utseende, kontrast og / eller lysstyrke identisk til de omkringliggende slice, og noen ganger beliggenhet ved overflaten av skive. Det er mulig å registrere både fra friske terminalene dypt i slice (fordel: mer intakt synaptiske kretser), og også nær overflaten av skive (advantage: raskere tilgang til perfused narkotika i den eksterne løsningen; lettere å forsegle).
5. Elektrofysiologiske opptak og Ca 2 + bildebehandling
- Ved hjelp av en sprøyte med et 0,2 mikrometer filter tip (Nalgene), fyll glasset patch pipetten med intern løsning på et nivå 1-2 centimeter fra baksiden av pipetten. Etter å ha fjernet luftbobler fra spissen, sikre pipetten i holderen, påfør positivt trykk (1.2 til 1.6 psi), og flytt det mot målrettet terminalen ved hjelp av en micromanipulator (MPC-200, Sutter Instrument). Mens du beveger tuppen nedover gjennom stykket, flytt pipetten i en lateral feiende retning for å sikre at stykket ikke er trukket sammen med spissen.
- Flytt pipettespissen rundt terminalen å rengjøre membran overflate. Skyv spissen nedover på kanten av terminalen for å lage en smilehull (strekpunkt), og slipp den positive trykket. Hvis en GΩ forseglingen ikke danner umiddelbart, gjelder svak negativ press. Etter en GΩ segl, bytte til on-celle opptaksmodus av EPC-9 patch clamp forsterker og endrer holde potensiale til -60 eller -70 mV. Påfør C-rask (fast-kapasitans) korreksjon, vente på at forseglingen å stabilisere mellom 5-10 GΩ, og deretter ruptur membranen med skarpe, skånsom sugefunksjon anvendt av munnen til å etablere hel-celle opptak konfigurasjon. Dersom hele-celle konfigurasjon er korrekt etablert, vil seriemotstand være mellom 14-30 MΩ. Input motstand vil være 200-500 MΩ for intakt terminaler og 1-3 GΩ for axotomized terminaler 14.
- Observer kapasitiv strøm forbigående (figur 2a og 2c), å skille mellom intakt og axotomized bipolar celle terminaler. Intakt og axotomized Mb terminaler har en baseline membran kapasitans 9-16 pF og 3-8 pF, henholdsvis.
- Påfør en 200 ms varighet spennings-clamp steg -70 til 0 mV til en axotomized Mb terminal. Dette vil tillatedirekte måling av store (~ 200-600 PA), isolerte innover Ca 2 + strømmer aktiveres ved åpningen av spennings-avhengig L-type Ca 2 + kanaler (Figur 2b). Parallelt er man i stand til å overvåke kapasitans hopp forårsaket av eksocytose av synaptiske vesikler, og den raske, pH-mediert hemming av Ca 2 + strøm som følger eksocytose 15, og gabaergic gjensidig feedback-hemming (figur 3c, 22). Hvis man patcher en intakt Mb bipolar celle terminal vil resultatet bli som vist i Figur 2c og 2d. Ingen merkbar Ca 2 + strømmer er observert på grunn av den store "lekke" strømninger grunn gap-krysset kobling i dendritter av Mb bipolare cellene 1.
- Membran kapasitans endringer kan være fremkalt av et skritt depolarisering fra driftsenheten potensialet i -70 mV til 0 mV bruke "sinus + DC" metode for tid-løst membranen kapasitans målinger 6. Membran kapasitans hopper indikerer sammensmeltingen av synaptiske vesikler med plasmamembranen. En 2 kHz sinusformet spenning-klemme kommando (30 mV peak-to-peak) ble lagt til avholdelse potensialet i -70 mV. Innspillingen nåværende ble analysert på to ortogonale fase vinkler av EPC-9 patch-clamp forsterker software emulering av en lock-in forsterker (Heka, Lambrecht, Tyskland). I intakt terminalen i figur 2d, en høy frekvens (2 kHz) sinusformet stimulus confines membranen kapasitans som er analysert til terminalen avslutninger og axon, som har en baseline kapasitans Cm ~ 6,8 pF. Membranen i cellen kroppen og dendritter av bipolare cellen er dermed filtrert ut av høyfrekvente spenningen-klemme sinusbølge 13.
- For Ca 2 +-imaging eksperimenter, blandes den interne patch pipetten løsning med Ca 2 +-sensitive fluorescerende fargestoff (f.eks Oregon Grønn 488 BAPTA-1 (100-200 mM, O-6806, Invitrogen)) og gjenta protokollen fra 50,1 til 5,5. Dette vil tillate en å kombinere fluorescens bildebehandling og elektrofysiologiske opptak. For eksempel er det mulig å avbilde Ca 2 + forbigående forbundet med en 200 ms steg -70 til 0 mV i den lille telodendria vedheng av Mb terminal (figur 3a, b). Vi har integrert vår oppreist Olympus mikroskop med en roterende disk laser confocal mikroskop system (CSU-X1, Yokogawa). Den confocal mikroskopet bruker 488 nm og 561 nm laser linjer som er modulert av en acousto optisk tunbare filter. Data er ervervet bruker Slidebook programvare (3i; Intelligent Imaging Instruments). For ytterligere detaljer om kalsium imaging teknikker bruker gullfisk retinal nevroner se 24, 17, 3.
Trouble Shooting:
Hvis man ofte unnlater å etablere et hel-celle konfigurasjon, selv etter dannelsen av en stabil GΩ sel, kan det være nyttig å redusere de negative trykket som brukes til å punktere terminalen megmbrane. Det kan også være slik at optimal sugetrykk for etablering av hel-celle konfigurasjon varierer som en funksjon av membran krumning (soma> terminal). Det er også mulig å bruke en zap protokoll (Amplitude: 400 mV, Varighet: 100 μs) å gå inn i hel-celle konfigurasjon, enten alene eller i kombinasjon med en skarp puls av negativt trykk. Vi har funnet zap-protokollen til å være spesielt nyttig for innbrudd når du bruker et pipettespiss med et bad motstand i overkant av 12 MΩ.
Seks. Representant Resultater
Figur 1. Identifikasjon av Mb bipolar celle terminaler i gullfisk retinal skiver. (Ac) IR-DIC bilder av Mb bipolar celle terminaler. Vi kan identifisere sannsynlige axotomized (axon-cut) og intakt terminaler i IR-DIC bilde. En axotomized terminal vises rundt og rundskriv, som vist i cmens en intakt terminal er mer sannsynlig å dukke elliptiske, som vist i a og b. Denne klassifiseringen kan bekreftes ved forbigående kapasitans måling (se figur 2) eller av fargestoff fylle metoden (d - f). Røde piler angitt plasseringen av skjæringspunktet mellom axon og axon terminal for intakt terminaler i a og b. Rød stiplet linje indikert konturen av Mb bipolar celle terminaler. (DF). Fluorescens bilder av Mb bipolar celle terminaler med intakt axon (d), en delvis kutt axon (e), eller en fullstendig fjernet axon (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) fluorescerende fargestoff var fylt med interne løsninger før opptak. Umiddelbart etter patch-clamp opptak ble retinal slice overført til 4% (wt / vol) Paraformaldehyde (P6148, Sigma) i fosfatbuffer løsning (70013, GIBCO) og inkubert i 30min. Skiver ble montert på Superfrost lysbilder (Fisher Scientific) i vandig montering medium med anti-fading agenter (Biomeda corp). Alexa 555 inneholder Mb bipolar celle terminaler ble sett med en 555 nm laser line (rød) ved hjelp av en 40x vann nedsenking objektiv på en confocal laser-scanning mikroskop (710 LSM, Carl Zeiss). Legg merke til tilstedeværelsen av små telodendria vedheng stikker ut fra axon terminaler (blå piler). Scale bar indikerer 10 mikrometer (a - f). INL: indre kjernefysiske lag, IPL: indre plexiform lag, GCL: ganglion celle laget.
Figur 2. Elektriske egenskapene til axotomized og intakt Mb bipolar celle terminaler. (A, c) Forbigående nåværende respons aktiveres av en spennings-klemme steg hyperpolarization fra driftsenheten potensialet i -60 mV til -70 mV. Den korte nåværende svar på en -10 mV spenning-klemme stegkan resultere i: 1) en eneste faste eksponentiell dagens decay med høy inngang motstand ved -70 mV (tegn på en axotomized terminal, panel a), eller 2) en dobbelt-eksponensiell decay med lav inngang motstand ved -70 mV (indikasjon på en intakt terminal, panel c, se også 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + strømmer og membran kapasitans hopp ble fremkalt av et skritt depolarisering -70 til 0 mV. Time-løst membranen kapasitans målinger bruke en 2-kHz sinusbølge stimulus oppå hviler holde potensialet i -70 mV 6. Den røde spor er den gjennomsnittlige verdien av kapasitans datapunkter. Merk at kapasitans hoppe i Figur 2b og 2d er begge lik ca 200 ff.
Figur 3. Direkte målinger av Ca 2 + bildebehandling signaler, eksocytose, og hemmende tilbakemeldinger i en Mb bipolar celle terminal. (A) En forbigående økning i Ca 2 + konsentrasjon i telodendria en Mb terminal ble aktivert av en spenning-klemme steg depolarisering -70 til 0 mV for 200 ms (pil). Oregon Grønn 488 BAPTA-1 (100 mM), en Ca 2 + indikator fargestoff, ble inkludert i patch pipetten. (B) Tilsvarende fluorescens bilde av Mb telodendria (region av interesse indikeres med rød stiplet linje). (C) Kortsiktig synaptiske depresjon av signalstoffet release (eksocytose). Ca 2 + strømmer (i midten spore) og membran kapasitans (nederste spor) fremkalt av et par 20 ms depolarizations til 0 mV (øvre spor, 200 ms inter-puls intervall). Pilen viser effekten av exocytosed protoner på Ca 2 + strøm og også gabaergic gjensidig feedback-hemming fra nabolandet amacrine celler 15, 21. Merk at proton-mediert hemming av Ca 2 + strøm og også GABAergic gjensidig feedback-hemming er til stede bare i den første depolariserende respons, som også har en kapasitans hopp på grunn av eksocytose av synaptiske vesikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk og vanskelig skritt i protokoll vårt er overføring av del av netthinnen inn i agar løsningen (protokoll 3.4). Det er nødvendig å forsiktig fjerne glasslegemet og rester slice løsning fra retinal stykke og overføre det uten forvrengning eller bøyd. For å oppnå dette bruker vi en liten slikkepott (21-401-25B, Fisherbrand) med et tips bøyd i en 90 ° vinkel, sammen med vinklet spiss tang (11251-35, Fine Science Tools), å plassere retinal stykke gjennom overføringsprosessen i skive løsning. Residual slice løsning på retinal skive og slikkepott kan fjernes ved forsiktig dabbing av overflate med hjørnet av et brettes eller rulles Kimwipes (Kimberly-Clark).
En annen vanlig måte å forberede transverse retinal skiver er filteret papir-basert protokoll 23. Kort fortalt er en invertert stykke hele netthinnen festet til et rektangel stykke Millipore filter disk (ganglion celle leggeer mot filteret papiret, fotoreseptoren lag vendt opp) og kutt i 250 mikrometer tykke skiver med en manuell vertikal "tommel" slicer (f.eks Narishige ST-20). Vi finner at fordelene av filteret papir-basert protokoll inkluderer sunnere fotoreseptorene og en økning forholdet axotomized til intakt Mb terminaler. Vi dermed bruke dette filteret papir metode for å lokke fram light-evoked respons fra én Mb terminaler innebygd i retinal skiver.
Fordelene med vår agar-basert protokoll over filteret papir-basert protokoll er at 1) det retinal slice produseres er flat, jevn, og relativt uskadet med klart skille mellom retinal lag, som muliggjør patching i noen indre kjernefysisk lag eller plexiform lag retinal celle som er ønsket, og 2) immunhistokjemi følgende elektrofysiologiske opptak er utført lettere grunn av intakt og flat geometri av stykket og faktorene nevnt i punkt (1) ovenfor. En protokoll for opptak lys responss av retinal nevroner i en agar-baserte forberedelser ble tidligere publisert i Jove 2. En horisontal retinal skive forberedelse som brukte en kombinasjon av agar og filter papir teknikker ble også tidligere publisert i Jove 5. Vi anbefaler å se disse videoene i kombinasjon med våre egne for å sammenligne de forskjellige teknikkene.
Direkte tilgang til bånd-type presynaptiske terminaler i virveldyr retinal skiver tillater oss å undersøke synaptisk overføring på bånd-type aktive soner. Den tillater oss også å direkte studere den synaptiske fysiologi i retinal microcircuits. Denne teknikken vil være spesielt nyttig for parede innspillinger av pre-og post-synaptiske signaler, med postsynaptiske partnere som hemmende amacrine celler og spiking ganglion celler 1, 16, 10. Sammenkoblede opptak på bånd-type synapser mellom rotte cochlea indre hårceller og afferent dendritter er mulig og har blitt beskrevet med 7. Kalsium imaging av Mb bipolar celle terminaler har blitt utført i akutt dissosiert celler 8 og i retinal skiver 17, samt i gullfisk amacrine celler 3. Nyere studier har vist store forbedringer for in vivo og in vitro optogenetic tilnærminger i transgene sebrafisk netthinnen fire. Fremtidige retninger vil trolig involvere disse transgene teknikker, sammen med elektrofysiologiske metoder, som vil tillate oss å bygge bro over gapet mellom in vitro slice opptak og in vivo imaging, fører til slutt til atferdsmessige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Fred Rieke for hans slags forklaring av agar-embedded retinal slice forberedelse da vi begynte å bruke protokollen i vårt laboratorium. Vi takker også Lori Vaskalis for illustrasjon av skjematisk oversikt og Drs. Veeramuthu Balakrishnan og Soyoun Cho for nyttige kommentarer til tekst og video. Dette arbeidet ble støttet av en NEI-NIH RO1 stipend, og var også delvis støttet av en Korea Research Foundation Grant finansiert av den koreanske regjeringen [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
