Summary
Her beskriver vi en protokol for forberedelse af agar-embedded retinal skiver, der er egnet til elektrofysiologi og Ca2 + billeddannelse. Denne metode gør det muligt at studere bånd-typen synapser i retina mikrokredsløb med direkte patch-clamp optagelser af en enkelt præsynaptiske nerveender.
Abstract
Visuelle stimuli opfanges og transporteres over et bredt dynamisk område af lys intensitet og frekvens ændringer af specialiserede neuroner i hvirveldyr nethinden. To klasser af retinale neuroner, fotoreceptorer og bipolære celler, opnå dette ved hjælp af bånd-typen aktive zoner, der gør det muligt vedvarende og high-throughput neurotransmitter release over lange perioder. ON-typen blandet bipolar celle (Mb) terminaler i guldfisk nethinden, som depolarisere for lys stimuli og modtage blandet stang og kegle fotoreceptor input, er egnet til studiet af bånd-typen synapser både på grund af deres store størrelse (~ 10-12 μm diameter) og deres talrige laterale og gensidige synaptiske forbindelser med amacrine celle dendritter. Direkte adgang til Mb bipolar celle terminaler i Goldfish retinal skiver med patch-clamp teknik giver mulighed for måling af præsynaptiske Ca 2 + strømme, membran kapacitans ændringer, og gensidig synaptic feedback hæmning medieret af GABA <sub> A og GABA C receptorer udtrykt på terminalerne. Præsynaptisk membran kapacitans målinger af exocytose tillader en at studere på kort sigt plasticitet excitatoriske neurotransmitter release 14,15. Derudover kan kortsigtede og langsigtede plasticitet hæmmende neurotransmitter frigivelse fra amacrine celler også blive undersøgt af optagelser af gensidige feedback hæmning ankommer til Mb terminalen 21. Over kortere perioder (fx ~ 10 s), undergår GABAergic gensidig feedback hæmning fra amacrine celler parret-puls depression via GABA vesikel pool udtynding 11. Den synaptisk dynamik retinal mikrokredsløb i den indre plexiform lag af nethinden kan således direkte undersøgt.
Hjernen-slice teknik blev indført mere end 40 år siden, men er stadig meget nyttigt for undersøgelsen af de elektriske egenskaber af neuroner, både på enkelt celle soma, enkelt dendritceller eller Axon, og microcircuit synaptiske niveau 19. Væv, der er for lille til at være limet direkte på udskæring kammer ofte er de første indlejret i agar (eller placeres i et filter papir) og derefter skåret 20, 23, 18, 9. I denne video beskæftiger vi før forankring agar teknik med guldfisk nethinden. Nogle af de gigantiske bipolar celle terminaler i vores skiver af guldfisk nethinden er axotomized (Axon-klip) under udskæring procedure. Dette giver os mulighed for at isolere en enkelt præsynaptiske nerve terminal indgange, fordi optagelse fra axotomized terminaler udelukker signalerne fra soma-dendritiske rum. Alternativt kan man også optage fra intakte Mb bipolare celler, ved at optage fra terminaler knyttet til axoner, som ikke er skåret under udskæring procedure. Samlet set vil anvendelsen af denne forsøgsplan støtte i studier af retinale synaptisk fysiologi, mikrokredsløb funktionel analyse, og synaptisk transmission på bånd synapser.
Protocol
1. Eksterne og interne løsninger
- Forbered udskæring opløsning (lavt calcium) fra 10x stamopløsningen og tilsæt MgCl 2, CaCl 2, og D-glucose dagligt. Den endelige 1x Løsningen består af (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glucose, 0,2 L-ascorbinsyre, 12 HEPES. Indstil pH til 7,4 (med NaOH), og juster osmolaritet til 260 mOsm (ved hjælp af H 2 O og 10x stamopløsning).
- Der afvejes 3% lave geldannende temperatur agar (Agarose type VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) og bland med udskæring løsning. Varm agar indeholdende løsning i en mikrobølgeovn i 1-2 minutter, eller indtil det opløses fuldstændigt, og inkubér agar anbringes i et vandbad (30-33 ° C) for at forhindre hurtig størkning (gel overgang temperatur: 26 ± 2 ° C).
- Forbered optagelse opløsning (normal calcium) fra 10x stamopløsningen og tilsæt MgCl 2, CaCl 2, og D-glucose dagligt. Den endelige 1x løsning konsistensts af (i mm): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 L-ascorbinsyre, 2,5 CaCl 2, 12 D-glucose. Efter boblende løsningen i 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen) i 5-10 minutter, indstilles pH til 7,4 (med NaOH), og juster osmolaritet til 260 mOsm (ved hjælp af H 2 O og 10x stamopløsning).
- Alikvoter (1 ml hver) af interne pipette løsninger er udarbejdet i forvejen og opbevares i en fryser (-20 ° C). To interne pipette løsninger typisk bruges til at isolere bipolar celle calcium strømninger (i mm):
- 40 CsCl, 60 Cs-gluconat, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 mg-ATP, 1 Na-GTP, og 2 EGTA. Justér pH til 7,2 (med CsOH) og osmolaritet sat til 250 mOsm. Denne høje klorid intern løsning typisk giver lavere serie modstand optagelser (bedre spænding klemme vilkår) og større hæmmende postsynaptiske strømninger (IPSCs) på en bipolar celle hvilende membran potentialet på -60 mV.
- 95 Cs-gluconat, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 mg-ATP, 0,5 Na-GTP, og 0,5 EGTA. Justér pH til 7,2 (med CsOH), og indstil osmolaritet til 250 mOsm 22. Denne lave EGTA intern løsning, typisk fører til højere membran kapacitans ændringer fremkaldt af depolariserende skridt impulser og dermed giver mulighed for studier af vesikel pool udtømning og kortsigtede depression.
2. Patch-clamp pipette elektroder
- Forbered tykvæggede (1,5 mm udvendig diameter) borosilikatglas (1B150F-4; Verdens præcisions-instrumenter, Sarasota, FL) og træk plaster pipetter med en lodret aftrækker (Narishige, PP830, Tokyo, Japan). Open-tip patch pipette modstande i optagelses-løsninger er 7-8 MOhm når pipetten er fyldt med intern pipette løsning # 1.
- Coat plasteret-pipette jævnt, fra spidsen til niveauet af akslen, der når pipette indehaveren, med dental voks (Cavex, West Chester, PA). Dette vil minimere pipetten kapacitans og elektrisk støj og gør det muligtmere præcis og støjsvag kapacitans målinger. En lav pipette kapacitans hjælper også den elektroniske C-FAST (hurtig kapacitans) kompensation af EPC-9 (eller EPC-10) patch clamp forstærker.
3. Udarbejdelse af agar-embedded retinal skiver
- Vælg en guldfisk (Carassius auratus, 8-16 cm) og placeres i en overdækket spand i et mørkt rum i 30 min af mørke tilpasning. Efter anæstesi, aflive de bedøvet guldfisk ved hurtig halshugning og dobbelt-rygmarvsstødning i rygmarven og hjernestammen. Derefter fjerne øjnene med buede-spids saks og buede-spids pincet. Disse procedurer er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Komité (IACUC) ved Oregon Health & Science University.
- Hemisect hvert øje ved at skære jævnt omkring den forreste del af øjet med fjeder sakse (15003-08, Fin Science Tools; indlede skåret af punktering med saks tips), og placer øjestykker i kølet slice opløsning (lavt calcium). Hvis necessary, skal du fjerne linsen med en pincet (linsen vil normalt tag med den forreste del af øjet). Fjern nethinden med pigment epitel fastgjort ved hjælp af et par 45 ° vinklet spids fin pincet (11251-35, Fin Science Tools) at skrælle nethinden væk fra øjestykket, der udvikler sig langsomt rundt i hele 360 °. Sever eller klippe synsnerven med enten fin pincet eller foråret saks. Fjern nethinden forsigtigt med en kombination af vinklet fine spids pincet og suges der fra en modificeret Pasteur pipette eller overførselspipetten (store spids). Brug vinklet fin spids pincet til at fjerne den resterende del af pigment epitel knyttet til nethinden. Overfladen af den rensede og sunde nethinden skal vises mørkt, glat og rød farvet. For en fuldstændig fjernelse af alle mørke pigment epitel celler mørke tilpasse nethinden i 1 time (8, 1992).
- Forkæl isoleret nethinden med ~ 0,03% (vægt / vol; ~ 0,36 mg / ml i 1x skive opløsning) hyaluronidase (3; H6254, Sigma) i 15-30 min ved stuetemperaturtemperatur (20-23 ° C) til at fjerne glaslegemet. Under denne inkubering, kan du forberede iskolde skive løsning.
- Skær et rektangulært stykke af nethinden (~ 2x2 mm, som indeholder den fulde tykkelse af nethinden) ved at fjerne den buede kanter med et lille segment af barberblad (Personna, tveægget, renses med 70% ethanol og H 2 O) knyttet til liget af en 1 ml plastik sprøjte, og overføre de retinale brik til en lille beholder fyldt med agar opløsning (tilberedt i (1.2)). Prøv at minimere mængden af løsningen omkring nethinden, da det er placeret i den flydende agar. Fordyb direkte i iskolde slice opløsning (tilberedt i (3.3)) til at størkne agar 20, 18, 9. Vi bruger en lille, håndlavede container. Kort fortalt, var en lille, cylindrisk rør (Fisherbrand, Polyethylen prøve hætteglas 2,5 ml, 03 til 338-1B), skåret i begge ender og forseglet med Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging) pletter.
- Skær solide agar blok i en 1x1x1 cm terning med det rektangulære stykke af nethinden.
- Overfør blok til den skive kammer og lim det på overfladen af den udskæring pladen. Den skive kammeret er pre-afkølet i en fryser (-20 ° C). Skær blok til 200-250 μm tykke skiver med en Vibratome pålægsmaskine (VT1000S eller VT 1200S, Leica) i iskolde skive løsning. I alt 5 til 10 skiver kan opnås, som er rentabelt for omkring 5 til 6 timer.
- Overfør en af skiverne til optagelsen kammeret. Anbring et gitter af nylon tråde limet til en U-formet platin frame 19 på toppen af den skive, og perfuse kontinuerligt (sats på 1-2 ml pr minut) med optagelse løsning boblede med 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen ).
Trouble Shooting:
Hvis nethinden brik indlejret i agar blokken er løs eller kommer ud af agaren under udskæring, kan man øge snittykkelse fra 200 μm op til 300 ìm i intervaller af 20 μm. Prøv også at minimere mængden af løsningen omkring nethinden, som den er overdraget, og placeret i den flydende agar ved at suge op extra løsning med en rullede "Kimwipe" papir tip. En anden måde at undgå dette problem er at reducere størrelsen af retinale brik i første omgang placeret i agar. Fordi glaslegemet forbyder agar fra fuldt knyttet til de retinal stykke, kan det være nødvendigt at lave frisk hyaluronidase eller justere inkubationstiden (trin (3.3)).
4. Identifikation af bipolar celle synaptiske terminal i et retina skive
- Placer retinal skive under den opretstående mikroskop (f.eks BX51WI, Olympus). Vi ser det retinale skive med infrarød forskellen interferens kontrast (IR-DIC) optik gennem en 60x vand-nedsænkning mål (NA 0,90, Olympus) og CCD kamera (XC-75, Sony). Udgangen af CCD-kameraet er sendt til et kamera controller (C2400, Hamamatsu) for kontrast ekstraudstyr, før visualisering på en analog Sony 13 "black og hvid skærm. Mikroskopet er monteret på en XY oversættelse etape, og optagelsen kammeret er placeret på en fast scene 14.
- Find enten intakt og axotomized (Axon-cut) bipolar celle terminaler, som kan identificeres ved deres størrelse, form og placering i skive (Figur 1). Axotomized og intakt terminaler kan også skelnes ved undersøgelse af deres kapacitativ forbigående nuværende forfald gange (single eksponentiel versus dobbelt-eksponentiel henfald, henholdsvis) og Ca 2 + strømme (figur 2, 12, 14, 15). Mb terminaler er beliggende i den mest proksimale lag af sublamina b (ON-tekstlag, der støder op til ganglion celle lag) i den indre plexiform lag af guldfisk nethinden. Mb terminaler, med deres mat overflade og flade udseende, kan let skelnes fra ganglion og fordrevne amacrine listen over SOMA, som synes fase-lyse og sfæriske. Desuden er kanten af Mb terminaler er dækket med en højtæthed af synaptisk kontakter, og fremstår ru og uregelmæssig i forhold til den glatte, rene overflader af ganglion og amacrine celler (Figur 1a-c). Axotomized Mb terminaler vises rundt og nær cirkulære (figur 1c), mens intakte terminaler synes elliptiske og strakte, ofte med en klemt ende peger mod den indre nukleare lag af nethinden (figur 1a, b).
- Beskadigede eller usunde terminaler ser ofte hævede og vise flere små kornede strukturer på overfladen. Det kan være muligt at opnå en GΩ segl på disse terminaler, men de er tilbøjelige til at briste kort efter break-in. Andre tegn på usund terminaler omfatter et hult udseende, kontrast og / eller lysstyrke identisk med det omgivende skive, og nogle gange beliggenhed på overfladen af den skive. Det er muligt at optage både fra sunde terminaler dybt inde i skive (fordel: mere intakte synaptic kredsløb) og også nær overfladen af den skive (ADVantage: hurtigere adgang til perfunderet narkotika i ekstern løsning samt lettere at forsegle).
5. Elektrofysiologiske optagelser og Ca 2 + billedbehandling
- Brug en sprøjte med et 0,2 μm filter, spids (Nalgene), fyld glasset patch pipetten med intern løsning på et niveau 1-2 centimeter fra bagsiden af pipetten. Efter at have fjernet luftbobler fra spidsen, sikker pipetten i holderen, anvende positivt tryk (1,2-1,6 psi), og flyt den mod målrettet terminalen ved hjælp af en mikromanipulator (MPC-200, Sutter Instrument). Mens du flytter spidsen nedad gennem den skive, bevæger pipetten en lateral fejende retning for at sikre, at den skive ikke er trukket sammen med spidsen.
- Flyt pipettespidsen rundt om terminalen til at rense membranen overflade. Tryk spidsen nedad på kanten af terminalen til at skabe et smilehul (led), og slip positivt tryk. Hvis en GΩ forsegling ikke udgør det samme gælder let undertryk. Efter en GΩ sæl, skifte til on-celle optagelse af EPC-9 patch clamp forstærker og ændre den bedrift potentiale til -60 eller -70 mV. Påfør C-FAST (hurtig-kapacitans) korrektion, vente på, at forseglingen at stabilisere mellem 5-10 GΩ, og derefter brud membranen med skarpe, blide suges der gennem munden at etablere hel-celle optagelse konfiguration. Hvis hele-celle-konfiguration er korrekt etableret, vil serie modstanden være mellem 14-30 MOhm. Indgangsmodstand vil være 200-500 MOhm for intakt terminaler og 1-3 GΩ for axotomized terminaler 14.
- Overhold kapacitive nuværende forbigående (Figur 2a og 2c), at skelne mellem intakt og axotomized bipolar celle terminaler. Intakt og axotomized Mb terminaler har en baseline membran kapacitans på 9-16 pF og 3-8 pF, hhv.
- Påfør et 200 ms varighed spænding-clamp skridt fra -70 til 0 mV til en axotomized Mb terminal. Dette vil givedirekte måling af store (~ 200-600 pa), isoleret indad Ca 2 + strømme aktiveres ved åbningen af spændings-afhængige L-type Ca 2 + kanaler (figur 2b). Parallelt hermed er én i stand til at overvåge kapacitans hoppe forårsaget af exocytose af synaptiske vesikler, og den hurtige, pH-medieret hæmning af Ca 2 + strøm, der følger exocytose 15, og GABAergic gensidige feedback hæmning (Figur 3c 22). Hvis man lapper en intakt Mb bipolar celle terminal resultatet bliver som vist i figur 2c og 2d. Ingen mærkbar Ca 2 + strømme overholdes på grund af den store "lække" strøm på grund af gap-junction-kobling i dendritter af Mb bipolære celler 1.
- Membrane kapacitans ændringer kan fremkaldes af et skridt depolariseringen fra bedriften potentiale -70 mV til 0 mV ved hjælp af "sinus + DC" metode til tidsopløst membran kapacitans målinger 6. Membrane kapacitans hopper viser en sammensmeltning af synaptiske vesikler med plasmamembranen. En 2 kHz sinusformet spænding-clamp-kommando (30 mV spids til spids) blev tilføjet til afholdelse potentiale -70 mV. Optagelsen nuværende blev analyseret på to ortogonale fasevinkler af EPC-9 patch-clamp forstærker software-emulering af en lock-in forstærker (Heka, Lambrecht, Tyskland). I intakt terminal figur 2d, en høj frekvens (2 kHz) sinusformet stimulus begrænser membranens kapacitans, der er analyseret for at terminalen slutninger og Axon, som har en baseline kapacitans Cm ~ 6,8 pF. Membranen af cellen krop og dendritter af bipolar celle er således filtreret ud af den høje frekvens spænding-clamp sinusbølge 13.
- For Ca 2 +-billeddannelse eksperimenter, blandes grundigt interne patch pipette løsning med en Ca 2 +-følsomme fluorescerende farvestof (f.eks Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 μM; O-6806, Invitrogen)) og gentag protokol fra 50,1 til 5,5. Dette vil give en til at kombinere fluorescens billedbehandling og elektrofysiologiske optagelse. For eksempel er det muligt at billedet af Ca 2 + forbigående forbundet med et 200 ms skridt fra -70 til 0 mV i den lille telodendria vedhæng af Mb terminalen (Figur 3a, b). Vi har integreret vores oprejst Olympus mikroskop med en roterende disk laser konfokal mikroskop system (CSU-X1, Yokogawa). Den konfokal mikroskop bruger 488 nm og 561 nm laser linjer, der er gradueret efter en acousto-optisk afstemmelige filter. Data er erhvervet ved hjælp af Slidebook software (3i; Intelligent Imaging instrumenter). For yderligere oplysninger om calcium imaging teknikker, der anvender guldfisk retinale neuroner se 24, 17, 3.
Trouble Shooting:
Hvis man ofte undlader at etablere en hel-celle konfiguration, selv efter dannelsen af en stabil GΩ sæl, kan det være nyttigt at reducere de negative bruges pres for at punktere terminalen migmbrane. Det kan også være tilfældet, at optimale sugetryk for etablering af hel-celle konfiguration varierer som en funktion af membran krumning (Soma> terminal). Det er også muligt at bruge en zappe protokol (Amplitude: 400 mV, Varighed: 100 mikrosekunder) at komme ind i hel-celle konfiguration, enten alene eller i kombination med en skarp puls undertryk. Vi har fundet zappe-protokollen til at være særlig nyttig for break-in, når du bruger en pipette spids med et bad modstand i over 12 MOhm.
6. Repræsentative resultater
Figur 1. Identifikation af Mb bipolar celle terminaler i Goldfish retinal skiver. (Ac) IR-DIC billeder af Mb bipolar celle terminaler. Vi kan identificere sandsynlige axotomized (Axon-cut) og intakt terminaler i IR-DIC billede. En axotomized terminal vises runde og cirkulære, som vist i Cmens en intakt terminal er mere sandsynligt at blive vist elliptiske, som vist i A og B. Denne klassificering kan bekræftes ved forbigående kapacitans måling (se figur 2) eller ved farvestoffet udfylde metoden (d - f). Røde pile er angivet placeringen af krydset mellem Axon og Axon terminalen til den intakte terminaler i a og b. Røde stiplede linie angivet konturen af Mb bipolar celle terminaler. (DF). Fluorescens billeder af Mb bipolar celle terminaler med en intakt Axon (d), en delvist skåret Axon (e), eller et fuldt fjernet Axon (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) fluorescerende farvestof var fyldt med intern opløsning før optagelsen. Umiddelbart efter patch-clamp optagelse, blev nethinden skive overført til 4% (vægt / vol) paraformaldehyd (P6148, Sigma) i fosfatbuffer (70.013, GIBCO) og inkuberes i 30min. Skiver blev monteret på SuperFrost dias (Fisher Scientific) i vandig montering medie med anti-fading agenter (Biomeda corp). Alexa 555 indeholder Mb bipolar celle terminaler blev set med en 555 nm laser linje (rød) med en 40x vand-nedsænkning mål på en konfokal laser-scanning mikroskop (LSM 710, Carl Zeiss). Bemærk tilstedeværelsen af små telodendria vedhæng stikker ud fra Axon terminaler (blå pile). Skala bar viser 10 ìm (a - f). INL: inderste nukleare lag, IPL: inderste plexiform lag, GCL: ganglion cellelag.
Figur 2. Elektriske egenskaber af axotomized og intakt Mb bipolar celle terminaler. (A, c) Forbigående nuværende reaktion aktiveres af en spændings-clamp trin hyperpolarisering fra den bedrift potentialet på -60 mV til -70 mV. Den korte aktuelle reaktion på en -10 mV spændings-clamp trinkan resultere i: 1) en enkelt hurtig eksponentiel nuværende henfald med høj indgangsmodstand ved -70 mV (vejledende af en axotomized terminal, panel a), eller 2) en dobbelt-eksponentiel kurve med lavt input modstand ved -70 mV (vejledende af en intakt terminal Panel C, se også 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + strømme og membran kapacitans hop blev fremkaldt af et skridt depolarisering fra -70 til 0 mV. Tidsopløst membran kapacitans målinger bruger en 2-kHz sinusbølge stimulus oven på den hvilende holde potentiale -70 mV 6. Den røde kurve er den gennemsnitlige værdi af kapacitans datapunkter. Bemærk, at kapacitans hoppe i figur 2b og 2d er både lig med omkring 200 ff.
Figur 3. Direkte målinger af Ca 2 + billedbehandling signaler, exocytose, samt hæmmende feedback i et Mb bipolar celle terminal. (A) En forbigående stigning i Ca 2 + koncentration i telodendria af en Mb terminal blev aktiveret af en spændings-clamp trin depolarisering fra -70 til 0 mV til 200 ms (pil). Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 mM), en Ca 2 + indikator farvestof, var inkluderet i plasteret pipette. (B) Tilsvarende fluorescens billede af Mb telodendria (region af interesse markeret med rød stiplet linie). (C) Kortvarige synaptisk depression af neurotransmitter release (exocytose). Ca 2 + strømme (i midten trace) og membran kapacitans (lavere trace) fremkaldt af et par på 20 ms depolarizations til 0 mV (øverste spor, 200 ms inter-puls interval). Pilen angiver effekten af exocytosed protoner på Ca 2 + nuværende og også den GABAergic gensidige feedback hæmning fra nabolandet amacrine celler 15, 21. Bemærk, at proton-medieret hæmning af Ca 2 + nuværende og også GABAergic gensidige feedback hæmning er kun til stede i den første depolariserende svar, som også har en kapacitans hoppe på grund af exocytose af synaptiske vesikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk og vanskeligt skridt i vores protokol er overførslen af det stykke af nethinden i agar opløsning (protokol 3.4). Det er nødvendigt omhyggeligt at fjerne glaslegemet og resterende skive løsning fra den retinale brik og overføre det uden forvrængning eller bøjes. For at opnå dette, bruger vi en lille spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spids bøjet til at danne en 90 ° vinkel, sammen med vinklet spids pincet (11251-35, Fin Science Tools), at placere den retinale brik i hele overførslen i skive løsning. Resterende skive løsning på nethinden skive og spatel kan fjernes ved omhyggelig duppe af overflade med hjørnet af en foldet eller rullet Kimwipes (Kimberly-Clark).
En anden almindelig måde at forberede tværgående retinal skiver er filtret papirbaserede protokol 23. Kort fortalt, er en omvendt stykke af hele nethinden knyttet til et rektangel stykke Millipore filter disk (ganglion celle låis mod filtrerpapir, fotoreceptor lag opad) og skæres i 250 μm tykke skiver med en manuel lodret "tommelfinger" pålægsmaskine (f.eks Narishige ST-20). Vi finder, at fordelene ved filtrerpapir-baseret protokol omfatter sundere fotoreceptorer og en stigning forhold axotomized på intakt Mb terminaler. Vi bruger således dette filter papir metode til at fremkalde lys fremkaldt reaktioner fra en enkelt Mb terminaler indlejret i retinal skiver.
Fordelene ved vores agar-baseret protokol over filteret papir-baseret protokol er, at 1) den retinale producerede skive er flad, jævn, og relativt ubeskadiget med klar adskillelse mellem retinale lag, som gør det muligt for lappe på nogen inderste nukleare lag eller plexiform lag nethinde celle, der ønskes, og 2) immunhistokemi følgende elektrofysiologiske optagelse udføres lettere på grund af den intakte og flade geometri skive og de faktorer, der er nævnt i punkt (1) ovenfor. En protokol til optagelse på lyss af nethinden neuroner i en agar-baseret præparat er tidligere blevet udgivet i JOVE 2. En vandret retinal skive præparat, der anvendes en kombination af agar og filterpapir teknikker var også tidligere offentliggjort i JOVE 5. Vi anbefaler at se disse videoer i kombination med vore egne til at sammenligne de forskellige teknikker.
Direkte adgang til bånd-type præsynaptiske terminaler i hvirveldyr retina skiver giver os mulighed for at undersøge synaptisk transmission på bånd-type aktive zoner. Det giver os også mulighed for direkte at studere synaptiske fysiologi i retinal mikrokredsløb. Denne teknik vil være særlig nyttig for parret optagelser af præ-og post-synaptiske signaler, med postsynaptiske partnere, herunder hæmmende amacrine celler og spiking ganglion celler 1, 16, 10. Forbundne optagelser på bånd-typen synapser mellem rotte cochlear indre hårceller og afferente dendritter er muligt og er blevet beskrevet af 7. Calcium fantasing af Mb bipolar celle terminaler er udført i akut dissocierede cellerne 8 og i retinale skiver 17, samt i Goldfish amacrine celler 3. Nylige undersøgelser har vist store forbedringer for in vivo og in vitro optogenetic tilgange i transgene zebrafisk nethinden 4. Fremtidige retninger vil sandsynligvis medføre, at disse transgene teknikker, sammen med elektrofysiologiske metoder, som vil give os mulighed for at bygge bro over kløften mellem in vitro-skive optagelser og in vivo imaging, hvilket i sidste ende til adfærdsmæssige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen konkurrerende interesser til at videregive.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Fred Rieke for hans venlige forklaring på agar-embedded retinal skive forberedelse, da vi begyndte at bruge protokollen i vores laboratorium. Vi takker også Lori Vaskalis til illustration af skematisk overblik og Drs. Veeramuthu Balakrishnan og Soyoun Cho for nyttige kommentarer til tekst og video. Dette arbejde blev støttet af en NEI-NIH RO1 tilskud, og var også delvist støttet af en Korea Research Foundation Grant finansieret af den koreanske regering [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
