Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.
Abstract
Visuele prikkels worden gedetecteerd en getransporteerd over een breed dynamisch bereik van lichtintensiteiten en frequentie veranderingen door gespecialiseerde neuronen in de gewervelde netvlies. Twee klassen van retinale neuronen, fotoreceptoren en bipolaire cellen dit doen door gebruik ribbon-type actieve zones, waarvoor aanhoudende en high-throughput vrijkomen van neurotransmitters kunnen over langere periodes. ON-type gemengde bipolaire cel (Mb) terminals in de goudvis netvlies, die depolariseren aan het licht stimuli en te ontvangen gemengde staafjes en kegeltjes fotoreceptor inbreng, zijn geschikt voor de studie van de lint-type synapsen zowel vanwege hun grote omvang (~ 10-12 um diameter) en hun talrijke laterale en wederzijdse synaptische verbindingen met amacrine cel dendrieten. Directe toegang tot Mb bipolaire cel terminals in goudvissen netvlies plakken met de patch-clamp techniek maakt het mogelijk de meting van het presynaptische Ca 2 + stromingen, membraan capaciteit verandert, en wederzijdse feedback synaptische inhibitie gemedieerd door GABA <sub> A en GABA C-receptoren tot expressie gebracht op de terminals. Presynaptische membraan capaciteit metingen van exocytose toelaten dat een op de korte termijn plasticiteit van excitatoire neurotransmitters 14,15 bestuderen. Daarnaast kunnen op korte termijn en lange termijn plasticiteit van remmende neurotransmitter vrijlating uit amacrine cellen ook worden onderzocht door opnames van wederzijdse feedback inhibitie aankomst op de terminal Mb 21. Over korte tijd (bv. 10 ~ s), GABAergische wederzijdse feedback inhibitie van amacrine cellen ondergaat gepaarde puls depressie via GABA blaasje zwembad uitputting 11. De synaptische dynamiek van retinale microcircuits in de binnenste laag van plexiform het netvlies kan dus direct worden bestudeerd.
De hersenen-slice techniek was meer dan 40 jaar geleden geïntroduceerd, maar is nog altijd zeer bruikbaar voor het onderzoek van de elektrische eigenschappen van neuronen, zowel op de enkele cel soma, een dendriet of axon, en microcircuit synaptische level 19. Weefsels die zijn te klein om direct te verlijmen op de kamer snijden vaak de eerste ingebed in agar (of geplaatst op een filtreerpapier) en vervolgens in plakjes gesneden 20, 23, 18, 9. In deze video, we gebruik van de pre-embedding agar techniek met behulp van goudvissen netvlies. Een deel van de reus bipolaire cel terminals in onze plakjes van goudvissen retina zijn axotomized (axon-cut) tijdens het snijden procedure. Dit laat ons toe om enkele presynaptische zenuwuiteinde ingangen te isoleren, omdat het opnemen van axotomized terminals sluit de signalen van de soma-dendritische compartiment. Als alternatief kan men ook opnemen uit intacte Mb bipolaire cellen, door het opnemen van de terminals aan axonen die niet zijn gesneden tijdens het snijden procedure. In het algemeen zal het gebruik van dit experimenteel protocol hulp in studies van retinale synaptische fysiologie, microschakeling functionele analyse, en synaptische transmissie bij lint synapsen.
Protocol
1. Externe en interne oplossingen
- Bereid snijden oplossing (laag calcium) uit 10x stockoplossing en voeg MgCl 2, CaCl 2, en D-glucose dagelijks. De uiteindelijke oplossing bestaat uit 1x (in mm): 119 NaCl, KCl 2,5, 3,2 MgCl2, 0,25 CaCl2, 12 D-glucose, 0,2 L-ascorbinezuur, 12 HEPES. Stel de pH op 7,4 (met NaOH), en pas osmolariteit tot 260 mOsm (met behulp van H 2 O en 10x voorraad-oplossing).
- Weeg 3% laag gelerend temperatuur agar (Agarose type VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) en meng met het snijden oplossing. Verwarm de agar bevattende oplossing in een magnetron voor 1-2 minuten, of totdat het geheel is opgelost, en incubeer de agar in een waterbad (30-33 ° C) om de snelle stolling (gel transitie temperatuur te voorkomen: 26 ± 2 ° C).
- Bereid de opname-oplossing (normale calcium) uit 10x voorraad-oplossing en voeg MgCl 2, CaCl 2, en D-glucose dagelijks. De uiteindelijke oplossing 1x Consists van (in mm): 100 NaCl, KCl 2,5, een MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0.2 L-ascorbinezuur, 2,5 CaCl2, 12 D-glucose. Na het borrelen van de oplossing in 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen) gedurende 5-10 minuten, stel de pH op 7,4 (met NaOH), en pas osmolariteit tot 260 mOsm (met behulp van H 2 O en 10x voorraad-oplossing).
- Porties (1 ml per stuk) van de interne pipet oplossingen worden voorbereid en opgeslagen in een vriezer (-20 ° C). Twee interne pipet oplossingen worden meestal gebruikt om een bipolaire cel calcium stromen (in mm) te isoleren:
- 40 CsCl, 60 Cs-gluconaat, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, een Na-GTP, en 2 EGTA. Pas de pH op 7,2 (met CsOH) en osmolariteit ingesteld op 250 mOsm. Deze hoge chloride interne oplossing biedt doorgaans een lagere serieweerstand opnames (betere voltage clamp voorwaarden) en de grotere remmende postsynaptische stroom (IPSCs) bij een bipolaire cel rust membraanpotentiaal van -60 mV.
- 95 Cs-gluconaat, een0 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, en 0,5 EGTA. Pas de pH op 7,2 (met CsOH), en stel osmolariteit tot 250 mOsm 22. Deze lage EGTA interne oplossing leidt meestal tot hogere membraan capaciteit veranderingen uitgelokt door depolariseren stap pulsen en dus laat studies van blaasje pool uitputting en korte-termijn depressie.
2. Patch-clamp pipet elektroden
- Bereid dikwandige (1,5 mm buitendiameter) borosilicaatglas (1B150F-4; Wereld precisie-instrumenten, Sarasota, FL) en trek de patch pipetten met behulp van een verticale trekker (Narishige, PP830, Tokyo, Japan). Open-tip patch pipet weerstanden in de opname-oplossingen zijn 7-8 MΩ wanneer de pipet gevuld is met interne pipet oplossing # 1.
- De vacht van de patch-pipet gelijkmatig, vanaf de punt naar het niveau van de as die de pipet houder, met tandartsen (Cavex, West Chester, PA) bereikt. Dit zal de pipet capaciteit en elektrische ruis en makennauwkeuriger en geluidsarme capaciteit metingen. Een lage pipet capaciteit helpt ook de elektronische C-fast (snel capaciteit) compensatie van de EPC-9 (of een EPC-10) patch clamp versterker.
3. Voorbereiding van de agar-embedded netvlies plakken
- Selecteer een goudvis (Carassius auratus, 8-16 cm) en plaats in een overdekte emmer in een donkere kamer gedurende 30 minuten van donkere aanpassing. Na de verdoving, euthanaseren van de goudvis verdoofd door middel van snelle onthoofding en dubbele pithing van het ruggenmerg en de hersenstam. Verwijder vervolgens de ogen met gekromde-tip schaar en gebogen-tip pincet. Deze procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Oregon Health & Science University.
- Hemisect elk oog door te snijden gelijkmatig rond de voorkant van het oog met veer schaar (15003-08, Fine Science Tools; starten gesneden door prikken met een schaar tips), en plaats de oogschelpen in gekoelde slice-oplossing (laag calcium). Als necessary, verwijdert u de lens met een pincet (de lens meestal los met de voorzijde van het oog). Verwijder het netvlies met pigment epitheel bevestigd met behulp van een paar van 45 ° schuine punt fijn pincet (11251-35, Fine Science Tools) te pellen het netvlies weg van de oogklep, vordert langzaam om de volledige 360 °. Verbreken of knip de oogzenuw met ofwel fijn pincet of voorjaar schaar. Verwijder voorzichtig het netvlies met een combinatie van schuine fijne punt tang en zuiging toegepast vanaf een aangepaste Pasteur pipet of overdracht pipet (grote tip). Gebruik schuine fijne punt tang om de rest van het pigment epitheel aan het netvlies te verwijderen. Het oppervlak van de gereinigde en gezonde netvlies moeten verschijnen donker, glad en rood gekleurd. Voor volledige verwijdering van alle donkere pigment epitheel cellen donker aan te passen het netvlies gedurende 1 uur (8, 1992).
- Behandel geïsoleerde netvlies met ~ 0,03% (wt / vol; ~ 0,36 mg / ml in 1x slice oplossing) hyaluronidase (3; H6254, Sigma) voor 15-30 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur (20-23 ° C) om glasvocht te verwijderen. Tijdens deze incubatie, kunt u zich voorbereiden ijskoude slice oplossing.
- Knip een rechthoekig stuk van het netvlies (~ 2x2 mm, met de volledige dikte van het netvlies) door het verwijderen van de gebogen randen met een klein segment van scheermesje (Personna, tweesnijdend, schoongemaakt met 70% ethanol en H 2 O) bevestigd aan het lichaam van een 1 ml plastic spuit, en breng de retinale stuk naar een kleine container gevuld met agar-oplossing (bereid in (1.2)). Probeer de hoeveelheid oplossing te minimaliseren rond het netvlies als het is geplaatst in de vloeibare agar. Dompel direct in ijskoud slice-oplossing (bereid in (3.3)) tot de agar 20, 18, 9 stollen. We maken gebruik van een kleine, handgemaakte container. Kortom, was een kleine, cilindervormige buis (Fisherbrand, Polyethyleen monster flacons 2,5 ml, 03-338-1B) afgesneden aan beide uiteinden en verzegeld met Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging) patches.
- Snijd de vaste agar blok in een eenx1x1 cm kubus met daarin de rechthoekig stuk netvlies.
- Breng het blok naar de slice kamer en lijm deze aan het oppervlak van de plaat snijden. De slice kamer is vooraf gekoeld in een vriezer (-20 ° C). Snij het blok in de 200 tot 250 micrometer dikke plakken met behulp van een Vibratome slicer (VT1000S of VT-1200S, Leica) in ijskoude slice oplossing. Een totaal van 5 tot 10 plakjes kan worden verkregen, die levensvatbaar zijn ongeveer 5 tot 6 uur.
- Overdracht een van de plakjes om de opname kamer. Plaats een raster van nylon draden vastgelijmd aan een U-vormige platina kader 19 op de top van het segment, en perfuseren continu (snelheid van 1-2 ml per minuut) met een opname-oplossing borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen ).
Trouble Shooting:
Als het netvlies stuk zijn ingebed in de agar blok is los of komt uit de agar tijdens het snijden, kan men de slice dikte te verhogen van 200 micrometer tot 300 micrometer in stappen van 20 um. Ook proberen om de hoeveelheid van de oplossing te minimaliseren rond het netvlies als het wordt overgebracht en geplaatst in de vloeibare agar door te zuigen op een extra oplossing met een opgerolde "Kimwipe" papier tip. Een andere manier om dit probleem te voorkomen is het verminderen van de grootte van het netvlies stuk in eerste instantie geplaatst in de agar. Omdat glasvocht verbiedt agar van volledig verbonden aan het netvlies stuk, kan het nodig zijn om nieuwe hyaluronidase maken of de incubatietijd (stap (3.3)) aan te passen.
4. Identificatie van de bipolaire cel synaptische terminal in een netvlies slice
- Plaats de retina slice onder de microscoop rechtop (bijv. BX51WI, Olympus). Wij zien het netvlies slice met infrarood differentieel interferentie contrast (IR-DIC) optiek door middel van een 60x water-immersie objectief (NA 0,90, Olympus) en CCD-camera (XC-75, Sony). De output van de CCD-camera is naar een camera controller (C2400, Hamamatsu) voor contrastverbetering voor visualisatie op een analoge Sony 13 "black en wit monitor. De microscoop is gemonteerd op een XY vertaling podium, en de opname kamer wordt geplaatst op een vaste podium 14.
- Zoek een intact en axotomized (axon-cut) bipolaire cellen terminals, die kunnen worden geïdentificeerd door hun grootte, vorm en positie in de slice (figuur 1). Axotomized en intact terminals kunnen ook worden onderscheiden door onderzoek van hun capacitieve tijdelijke stroom verval keer (single exponentiële versus dubbel-exponentiële verval, respectievelijk) en Ca 2 + stromen (figuur 2, 12, 14, 15). Mb terminals bevinden zich in de meest proximale laag van sublamina b (ON-type laag, grenzend aan ganglion cellaag) in de binnenste laag van de plexiform goudvis netvlies. Mb terminals, met hun doffe oppervlak en platte uiterlijk, gemakkelijk te onderscheiden van ganglion en ontheemde amacrine SOMA, die verschijnen fase-helder en bolvormig. Bovendien is de rand van Mb terminals bedekt met een hogedichtheid van synaptische contacten, en lijkt ruw en onregelmatig in vergelijking met de gladde, schone oppervlakken van het ganglion en amacrine cellen (figuur 1a-c). Axotomized Mb terminals verschijnen rond en bijna cirkelvormige (figuur 1c), terwijl intact terminals lijken elliptische en uitgerekt, vaak met een geknepen einde de richting van de binnenste nucleaire laag van het netvlies (figuur 1a, b).
- Beschadigde of ongezonde terminals zien er vaak gezwollen en weer een aantal kleine korrelige structuren op het oppervlak. Het kan mogelijk zijn om een GΩ zegel op deze terminals te verkrijgen, maar ze zijn waarschijnlijk scheuren kort na de inbraak. Andere tekenen van ongezonde terminals omvatten een holle uiterlijk, contrast en / of helderheid identiek aan de omringende slice, en soms ligging aan het oppervlak van het schijfje. Het is mogelijk om zowel van gezonde terminals diep in de slice (voordeel: meer intact synaptische circuits) en ook in de buurt van het oppervlak van de slice (advantage: snellere toegang tot doorbloed drugs in de externe oplossing, makkelijker te zegel).
5. Elektrofysiologische opnamen en Ca 2 + imaging
- Met behulp van een injectiespuit met een 0,2 um filter tip (Nalgene), vul het glas patch pipet met interne oplossing voor een niveau 1-2 centimeter aan de achterkant van de pipet. Na het verwijderen van luchtbellen uit de tip, zet de pipet in de houder, van toepassing zijn positieve druk (1,2-1,6 psi), en verplaats deze naar de beoogde terminal met behulp van een micromanipulator (MPC-200, Sutter Instrument). Tijdens het verplaatsen van de tip naar beneden door de slice, verplaatst u de pipet in een zijwaartse richting vegen om ervoor te zorgen dat het schijfje niet is getrokken samen met de tip.
- Verplaats de pipetpunt rond de terminal aan het membraan oppervlak schoon te maken. Duw de punt naar beneden op de rand van de terminal naar een kuiltje (streepje) te creëren, en laat de positieve druk. Als een GΩ afdichting niet onmiddellijk vorm, toe te passen lichte onderdruk. Na een GΩ zegel, overschakelen naar de on-cel-opname modus van de EPC-9 patch clamp versterker en verander de holding mogelijkheid tot -60 of -70 mV. Breng de C-fast (snel-capaciteit) correctie, wacht tot de afdichting te stabiliseren tussen 5-10 GΩ, en vervolgens breuk het membraan met scherpe, zachte zuigkracht toegepast door de mond op de whole-cell configuratie-opname vast te stellen. Als het whole-cell configuratie correct is vastgesteld, zal serieweerstand tussen de 14 tot 30 MΩ. Ingangsweerstand zal worden 200-500 MΩ voor intacte terminals en 1-3 GΩ voor axotomized terminals 14.
- Let op de capacitieve stroom van voorbijgaande aard (Figuur 2a en 2c), om onderscheid te maken tussen intacte en axotomized bipolaire cel terminals. Intact en axotomized Mb terminals hebben een baseline membraan capaciteit van 9-16 pF en 3-8 pF, respectievelijk.
- Breng een 200 ms duur voltage-clamp stap -70 tot 0 mV tot een axotomized Mb terminal. Dit zal toelatenhet direct meten van grote (~ 200-600 pA), geïsoleerd binnen Ca 2 + stromen geactiveerd door het openen van voltage-afhankelijke L-type Ca 2 + kanalen (Figuur 2b). Parallel, een is in staat om de capaciteit springen veroorzaakt door de exocytose van synaptische blaasjes, en de snelle, pH-gemedieerde inhibitie van Ca 2 + stroom die exocytose 15 volgt, en GABAergische wederzijdse feedback inhibitie (figuur 3c, 22) monitor. Als men plekken een intacte Mb bipolaire cel terminal het resultaat zal zijn zoals weergegeven in figuur 2c en 2d. Geen waarneembare Ca 2 + stromen worden waargenomen als gevolg van de grote "lek" stromingen te wijten aan gap-junction koppeling in de dendrieten van de bipolaire cellen 1 Mb.
- Membraan capaciteit veranderingen kunnen worden opgeroepen door een stap depolarisatie van het bedrijf potentieel van -70 mV tot 0 mV behulp van de "sine + DC" methode van tijdsopgeloste membraan capaciteitsmetingen 6. Membraan capaciteit springt geven de fusie van synaptische blaasjes met de plasmamembraan. Een 2 kHz sinusvormige spanning-clamp command (30 mV piek-piek) werd toegevoegd aan de holding potentieel van -70 mV. De opname stroom werd geanalyseerd op twee orthogonale fasehoeken door de EPC-9 patch-clamp versterker software emulatie van een lock-in versterker (HEKA, Lambrecht, Duitsland). In de intacte terminal van figuur 2d, een hoge frequentie (2 kHz) sinusvormige stimulus beperkt de membraan capaciteit die is geanalyseerd om de terminal eindes en de axon, dat een baseline capaciteit Cm hebben ~ 6,8 pF. Het membraan van het cellichaam en dendrieten van de bipolaire cellen worden dus gefilterd door de hoge frequentie voltage-clamp sinusgolf 13.
- Voor Ca 2 +-imaging experimenten, meng grondig de interne patch pipet oplossing met een Ca 2 +-gevoelige fluorescente kleurstof (bv. Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 pM; O-6806, Invitrogen)), en herhaal het protocol van 50,1 tot 5,5. Dit zal toelaten om een fluorescentie-imaging en elektrofysiologische opname combineren. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om het imago van de Ca 2 + van voorbijgaande aard in verband met een 200 ms stap -70 tot 0 mV in de kleine telodendria aanhangsels van de Mb terminal (figuur 3a, b). We hebben onze geïntegreerde rechtop Olympus microscoop met een draaiende schijf laser confocale microscoop-systeem (CSU-X1, Yokogawa). De confocale microscoop maakt gebruik van 488 nm en 561 nm laser lijnen die worden gemoduleerd door een akoestisch-optische afstembare filter. De gegevens worden verkregen met behulp van Slidebook software (3i, Intelligent Imaging Instruments). Voor meer informatie over calcium-imaging-technieken met behulp van goudvissen het netvlies neuronen zie 24, 17, 3.
Trouble Shooting:
Als men vaak niet om een whole-cell configuratie, ook na de vorming van een stabiele GΩ zegel, kan het nuttig zijn om de gebruikte negatieve druk te verminderen om het doorprikken van de terminal membrane. Het kan ook zijn dat optimale zuigdruk voor de oprichting van whole-cell configuratie varieert in functie van membraan kromming (soma> terminal). Het is ook mogelijk om een zappen protocol (Amplitude: 400 mV, Duur: 100 us) te gebruiken om het whole-cell configuratie in te voeren, hetzij alleen of in combinatie met een scherpe puls van negatieve druk. We hebben de zap-protocol te zijn vooral nuttig voor break-in bij het gebruik van een pipet tip met een bad weerstand van meer dan 12 MΩ.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Identificatie van Mb bipolaire cel terminals in goudvissen netvlies plakken. (Ac) IR-DIC beelden van Mb bipolaire cel terminals. We kunnen identificeren waarschijnlijk axotomized (axon-cut) en intact terminals in de IR-DIC beeld. Een axotomized terminal verschijnt rond en rond, zoals in cterwijl een intact terminal heeft meer kans om te verschijnen elliptische, zoals weergegeven in a en b. Deze indeling kan worden bevestigd door voorbijgaande capacitieve meting (zie figuur 2) of door de kleurstof vullen methode (d - f). Rode pijlen aangegeven de locatie van de kruising tussen de axon en de axon terminal voor de intacte terminals in a en b. Rode stippellijn aangegeven de contour van Mb bipolaire cel terminals. (Df). Fluorescentie beelden van Mb bipolaire cel terminals met een intacte axon (d), een gedeeltelijk afgesneden axonen (e), of een volledig verwijderd axonen (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) fluorescente kleurstof werd gevuld met interne oplossing voorafgaand aan de opname. Direct na het patch-clamp-opname, was het netvlies plak overgebracht naar 4% (wt / vol) paraformaldehyde (P6148, Sigma) in fosfaatbuffer-oplossing (70013, GIBCO) en geïncubeerd gedurende 30min. Slices werden gemonteerd op Superfrost dia's (Fisher Scientific) in waterige montage medium met anti-fading middelen (Biomeda corp). Alexa 555 Mb met een bipolaire cel terminals werden bekeken met een 555 nm laser lijn (rood) met een 40x water-immersie objectief op een confocale laser-scanning microscoop (LSM 710, Carl Zeiss). Let op de aanwezigheid van kleine telodendria aanhangsels uitsteekt van de axon terminals (blauwe pijlen). Schaalbalk geven 10 micrometer (een - f). INL: binnenste nucleaire laag, IPL: binnenste plexiform laag, GCL: ganglion cellaag.
Figuur 2. Elektrische eigenschappen van axotomized en intact Mb bipolaire cel terminals. (A, c) Voorbijgaande huidige reactie geactiveerd door een voltage-clamp stap hyperpolarisatie van het bedrijf potentieel van -60 mV tot -70 mV. De korte huidige respons op een -10 mV voltage-clamp stapkan leiden tot: 1) een snelle exponentiële huidige verval met een hoge ingangsweerstand bij -70 mV (indicatief van een axotomized terminal, een panel), of 2) een dubbel-exponentieel verloop met lage input weerstand bij -70 mV (indicatief een intact terminal; panel c, zie ook 12, 14, 15). (B, d), Ca 2 + stromingen en membraan capaciteit sprongen werden opgeroepen door een stap depolarisatie -70 tot 0 mV. Tijdsopgeloste membraan capaciteitsmetingen gebruik maken van een 2-kHz sinusgolf stimulus bovenop de rust houden potentieel van -70 mV 6. De rode trace is de gemiddelde waarde van de capaciteit data punten. Merk op dat de capaciteit sprong in Figuur 2b en 2d zijn beide gelijk aan ongeveer 200 FF.
Figuur 3. Directe metingen van Ca 2 + imaging signalen, exocytose, en remmende feedback in een Mb bipolaire cel terminal. (A) Een tijdelijke stijging van de Ca 2 +-concentratie in de telodendria van een Mb terminal werd geactiveerd door een voltage-clamp stap depolarisatie -70 tot 0 mV voor 200 ms (pijl). Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 uM), een Ca 2 +-indicator kleurstof, werd opgenomen in de patch pipet. (B) Stemt overeen met fluorescentie beeld van de Mb telodendria (region of interest aangegeven met rode stippellijn). (C) op korte termijn synaptische depressie van neurotransmitters (exocytose). Ca 2 + stromen (midden sporen) en membraan capaciteit (onderste spoor), opgeroepen door een paar van 20 ms depolarizations op 0 mV (bovenste spoor; 200 ms inter-pulse interval). De pijl geeft het effect van exocytosed protonen op de Ca 2 + de huidige en ook de GABA-erge wederzijdse feedback inhibitie van naburige amacrine cellen 15, 21. Merk op dat de proton-gemedieerde remming van de Ca 2 + de huidige en ook de GABAergic wederzijdse feedback inhibitie zijn alleen aanwezig in de eerste depolariserende reactie, die ook een capaciteit sprong als gevolg van de exocytose van synaptische blaasjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritische en moeilijke stap in ons protocol is de overdracht van het stuk van het netvlies in de agar-oplossing (protocol 3.4). Het is noodzakelijk om voorzichtig te verwijderen het glasvocht en het resterende slice-oplossing uit de retina stuk en over te dragen zonder vervorming of buigen. Om dit te bereiken, gebruiken we een kleine spatel (21-401-25B, Fisherbrand) met een tip gebogen tot een hoek van 90 ° vormen, samen met schuine punt tang (11251-35, Fine Science Tools), om de retinale positie stuk het hele proces van overdracht in slice oplossing. Residuele slice oplossing op de retina slice en spatel kunnen worden verwijderd door voorzichtig deppen van het oppervlak met de hoek van een gevouwen of opgerold Kimwipes (Kimberly-Clark).
Een andere veel voorkomende manier om dwars netvlies plakken voor te bereiden is de filter op papier gebaseerde protocol 23. Kortom, is een omgekeerde stuk van gehele netvlies bevestigd aan een rechthoek stuk van Millipore filter schijf (ganglion cel layre tegen het filterpapier, fotoreceptor laag naar boven) en in 250 micrometer dikke plakken met een handmatige verticale "duim" snijschijf (bijv. Narishige ST-20). We vinden dat de voordelen van het filter op papier gebaseerde protocol gezonder fotoreceptoren en een toename van de verhouding tussen axotomized intact Mb terminals omvatten. We dus gebruik van deze filter papier methode aan het licht opgewekte reacties uitlokken van enkele Mb terminals ingebed in het netvlies plakken.
De voordelen van onze agar-gebaseerd protocol over het filter op papier gebaseerde protocol zijn dat 1) de geproduceerde netvlies schijfje plat is zelfs, en relatief onbeschadigd met een duidelijke scheiding tussen het netvlies lagen, waardoor het patchen in staat stelt in een binnenste nucleaire laag of plexiform laag netvlies cel die gewenst is, en 2) immunohistochemie volgende elektrofysiologische opname is gemakkelijker uitgevoerd omdat van de intacte en vlakke geometrie van de slice en de factoren vermeld in punt (1) hierboven. Een protocol voor het opnemen van lichte reacties van retinale neuronen in een agar-gebaseerde voorbereiding is eerder gepubliceerd in Jupiter 2. Een horizontale netvlies slice voorbereiding dat een combinatie van agar en filtreerpapier technieken die gebruikt werd eerder ook gepubliceerd in Jupiter 5. Wij raden het bekijken van deze video's in combinatie met onze eigen aan de verschillende technieken te vergelijken.
Directe toegang tot lint-type presynaptische terminals in gewervelde het netvlies plakken laat ons toe om synaptische transmissie te onderzoeken op ribbon-type actieve zones. Het stelt ons ook direct bestuderen van de synaptische fysiologie in het netvlies microschakelingen. Deze techniek zal vooral nuttig zijn voor gepaarde opnames van pre-en post-synaptische signalen, met postsynaptische partners, waaronder remmende amacrine cellen en stekelige ganglion cellen 1, 16, 10. Gepaarde opnames bij lint-type synapsen tussen de rat cochleaire binnenste haarcellen en afferente dendrieten zijn mogelijk en zijn beschreven door de 7. Calcium imaging van de Mb bipolaire cel terminals is uitgevoerd in acuut gedissocieerde cellen 8 en in het netvlies plakken 17, evenals in goudvissen amacrine cellen 3. Recente studies hebben aangetoond grote verbeteringen voor in vivo en in vitro optogenetic benaderingen in transgene zebravissen netvlies 4. Toekomstige richtingen zal waarschijnlijk betrekken van deze transgene technieken, samen met de elektrofysiologische methoden, die zal ons toelaten om de kloof tussen in-vitro-slice-opnamen en in vivo beeldvorming brug, leidt uiteindelijk tot gedragsonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen concurrerende belangen te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken dr. Fred Rieke voor zijn vriendelijke uitleg van de agar-embedded netvlies slice voorbereiding toen we begonnen met het protocol in ons lab. We danken ook Lori Vaskalis voor de illustratie van schematisch overzicht en Drs. Veeramuthu Balakrishnan en Soyoun Cho voor nuttige commentaar op de tekst en video. Dit werk werd ondersteund door een NEI-NIH RO1 te verlenen, en was ook gedeeltelijk ondersteund door een Korea Research Foundation Grant gefinancierd door de Koreaanse regering [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
