Summary
Här beskriver vi ett protokoll för beredning av agar inbäddade-retinal skivor som är lämpliga för elektrofysiologi och Ca2 + avbildning. Denna metod gör att man kan studera band-typ synapser i näthinnan mikrokretsar med direkt patch-clamp inspelningar av enstaka presynaptiska nervändslut.
Abstract
Visuella stimuli upptäcks och förmedlas över ett brett dynamiskt omfång av ljusintensiteter och förändringar ofta av specialiserade nervceller i ryggradsdjur näthinnan. Två klasser av näthinnans nervceller, fotoreceptorer och celler bipolär, åstadkomma detta genom att använda band-typ aktiva zoner, som möjliggör uthållig och hög genomströmning frisättningen av neurotransmittorer under långa tidsperioder. ON-typ blandad bipolär cell (Mb) terminaler i guldfisk näthinnan, som depolarize till ljus stimuli och får blandas tappar och stavar photoreceptor ingång, är lämpliga för studier av band-typ synapser både på grund av sin storlek (~ 10-12 ìm diameter) och deras många sidled och ömsesidiga synapsförbindelser med amakrina cell dendriter. Direkt tillgång till MB bipolär cell terminaler i Goldfish retinal skivor med patch-clamp teknik möjliggör mätning av presynaptiska Ca 2 + strömmar, membran förändringar kapacitans, och ömsesidig synaptiska feedback-hämning medierad av GABA <sub> A och GABA C-receptorer uttrycks på terminalerna. Presynaptiska membranet kapacitans mätningar av exocytos tillåter en att studera den kortsiktiga plasticitet i excitatoriska neurotransmittorn släppa 14,15. Dessutom kan kortsiktiga och långsiktiga plasticitet i inhibitoriska neurotransmittorn befrielse från amakrina celler också utredas av inspelningar av ömsesidig återkoppling hämning anländer till Mb plint 21. Under korta perioder (t.ex. ~ 10 s), genomgår GABAergic ömsesidig återkoppling hämning från amakrina celler parade puls depression via GABA vesikler poolen utarmning 11. Den synaptiska dynamik retinal mikrokretsar i den inre plexiform lagret av näthinnan kan därför vara direkt studeras.
Hjärnan-slice tekniken infördes mer än 40 år sedan men är fortfarande mycket användbar för undersökning av de elektriska egenskaperna hos nervceller, både på det enda cell soma, enkel Dendrite eller axon, och microcircuit synaptisk nivå 19. Vävnader som är för små för att limmas direkt på skivning kammaren ofta först inbäddade i agar (eller placeras på ett filtrerpapper) och sedan skivade 20, 23, 18, 9. I denna video använder vi före inbäddning agar teknik med guldfiskar näthinnan. Några av de gigantiska bipolära cellen terminaler i våra skivor av guldfisk näthinnan är axotomized (axon-cut) under skärning förfarandet. Detta tillåter oss att isolera enstaka presynaptiska ingångar nervändslut, eftersom inspelning från axotomized terminaler utesluter signalerna från soma-dendritiska facket. Alternativt kan en post även från intakta Mb bipolära celler, genom att spela in från depåer knutna till axoner som inte har sänkts under skivning förfarandet. Totalt sett kommer att använda denna experimentella protokoll stöd i studierna av näthinnans synaptiska fysiologi, mikrokrets funktionell analys och synaptisk transmission på band synapser.
Protocol
1. Externa och interna lösningar
- Förbered skivning lösning (lågt kalcium) från 10x stamlösningen och tillsätt MgCl 2, CaCl 2, och D-glukos dagligen. Den slutliga 1x Lösningen består av (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glukos, 0,2 L-askorbinsyra, 12 HEPES. Ställ pH till 7,4 (med NaOH) och justera osmolalitet till 260 mOsm (med H 2 O och 10x stamlösning).
- Väg upp 3% låg gelbildande temperatur agar (agaros typ VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) och blanda med skivning lösning. Värm agar innehåller lösningen i en mikrovågsugn i 1-2 minuter, eller tills det löser sig helt och inkubera agar i ett vattenbad (30-33 ° C) för att hindra den snabba stelning (gel övergången temperatur: 26 ± 2 ° C).
- Förbered inspelning lösning (normalt kalcium) från 10x stamlösningen och tillsätt MgCl 2, CaCl 2, och D-glukos dagligen. Den slutliga 1x lösningen konsekventts av (i mm): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 L-askorbinsyra, 2,5 CaCl 2, 12 D-glukos. Efter bubblande lösningen i 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen) i 5-10 minuter, ställ pH till 7,4 (med NaOH) och justera osmolalitet till 260 mOsm (med H 2 O och 10x stamlösning).
- Alikvoter (1 ml vardera) av interna pipett lösningar är förberedda i förväg och förvaras i frys (-20 ° C). Två interna pipett lösningar används vanligtvis för att isolera bipolär strömmar cell kalcium (i mm):
- 40 CsCl, 60 Cs-glukonat, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 mg-ATP, en Na-GTP, och 2 EGTA. Justera pH till 7,2 (med CsOH) och osmolaritet satt till 250 mOsm. Denna höga klorid intern lösning ger normalt lägre inspelningar serie resistans (bättre spänning klämma förhållanden) och större hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs) vid en bipolär cell vilar membranpotential på -60 mV.
- 95 Cs-glukonat, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 mg-ATP, 0,5 Na-GTP, och 0,5 EGTA. Justera pH till 7,2 (med CsOH), och ställ osmolalitet på 250 mOsm 22. Den låga EGTA intern lösning leder vanligtvis till högre förändringar membran kapacitans som framkallades av depolariserande steg pulser och därmed möjliggör studier av vesikler pool utarmning och kortsiktiga depression.
2. Patch-clamp pipett elektroder
- Förbered tjockväggiga (1,5 mm ytterdiameter) borsilikatglas (1B150F-4, World precisionsinstrument, Sarasota, FL) och dra plåstret pipetter med hjälp av en vertikal avdragare (Narishige, PP830, Tokyo, Japan). Öppet-tip patch pipett motstånd i inspelningen lösningar 7-8 Mohm när pipetten är fylld med intern pipett lösning # 1.
- Täck patch-pipett jämnt, från spetsen till den nivå av axeln som når pipetten innehavaren, med dentala vax (CAVEX, West Chester, PA). Detta minimerar pipetten kapacitans och elektriska störningar och möjliggörmer exakt och låg bullermätningar kapacitans. En låg pipett kapacitans hjälper också den elektroniska C-snabb (snabb kapacitans) ersättning i EPC-9 (eller EPC-10) patch clamp förstärkare.
3. Beredning av agar inbäddade-retinal skivor
- Välj en guldfisk (Carassius auratus, 8-16 cm) och placera i en täckt hink i ett mörkt rum i 30 min av mörka anpassning. Efter anestesi, avliva den sederad guldfisken genom snabb halshuggning och dubbelklicka nackstick av ryggmärgen och hjärnstammen. Ta sedan bort ögonen med böjd spets sax och böjda-tip pincett. Dessa förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Oregon Health & Science University.
- Hemisect varje öga genom att skära jämnt runt främre delen av ögat med fjäder sax (15.003-08, Fine Science Tools, initiera skära av punktering med sax tips), och placera ögonmusslor i kylda slice lösning (lågt kalcium). Om necessary, ta bort objektivet med pincett (linsen vanligtvis loss med framsidan av ögat). Ta bort näthinnan med pigmentepitel fäst med hjälp av ett par 45 ° vinklad spets fin pincett (11.251-35, Fine Science Tools) att skala näthinnan från ögonmusslan, långsamt runt 360 °. Sever eller klipp synnerven med antingen fin pincett eller sax våren. Ta näthinnan försiktigt med en kombination av vinklade fin spets pincett och sug tillämpas från en modifierad pasteurpipett eller överföringspipett (stora tips). Använd vinklade fin spets tång för att ta bort resten av pigmentepitel fäst vid näthinnan. Ytan på rengöras och friska näthinnan ska visas mörk, mjuk och röd. För komplett avlägsnande av alla mörka celler pigmentepitel mörka anpassa näthinnan under 1 timme (8, 1992).
- Behandla isolerade näthinnan med ~ 0,03% (vikt / vol; ~ 0,36 mg / ml i 1x skiva lösning) hyaluronidas (3, H6254, Sigma) i 15-30 minuter i rumstemperaturtemperatur (20-23 ° C) för att ta bort glaskropp. Under denna inkubation, kan du förbereda iskall skiva lösning.
- Skär en rektangulär bit av näthinnan (~ 2x2 mm, som innehåller hela tjockleken på näthinnan) genom att ta bort den böjda kanterna med ett litet segment av rakblad (Personna, tveeggat, rengörs med 70% etanol och H 2 O) bifogas kroppen av en 1 ml plastspruta, och överföra näthinnan bit till en liten behållare fylld med agar lösningen (beredd enligt (1.2)). Försök att minimera den mängd lösning kring näthinnan som den är placerad i vätskan agar. Sänk direkt i iskallt slice lösningen (beredd enligt (3.3)) för att stelna agarn 20, 18, 9. Vi använder en liten, handgjorda container. Kortfattat var en liten, cylindriskt rör (Fisherbrand, polyeten prov flaskor 2,5 ml, 03 till 338-1B) skär i båda ändar och förseglade med Parafilm (PM-996, Pechiney plastförpackningar) fläckar.
- Skär den fasta agar blocket i en 1x1x1 cm kub som innehåller rektangulära bit av näthinnan.
- Överför block till slice kammaren och limma fast den på ytan av skivning plattan. Segmentet kammaren är nedkylda i frys (-20 ° C). Skär blocket i 200-250 ìm tjocka skivor med en Vibratome slicer (VT1000S eller VT 1200, Leica) i iskallt slice lösning. Totalt 5 till 10 skivor kan erhållas som är lönsamt för ca 5 till 6 timmar.
- Överför en av de skivor till inspelningen kammaren. Placera ett rutnät av nylon trådar som limmats på en U-formad platina ram 19 på toppen av skiva, och BEGJUTA kontinuerligt (med 1-2 ml per minut) med inspelning lösning bubblade med 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogen ).
Felsökning:
Om näthinnans bit inbäddad i agar blocket lossnat eller kommer ut ur agar under skivning, kan man öka skiva tjocklek från 200 ìm upp till 300 nm i steg om 20 m. Försök också att minimera den mängd lösning kring näthinnan som överförs och placeras i vätskan agar genom att suga upp extra lösning med en rullad "Kimwipe" papper spets. Ett annat sätt att undvika detta problem är att minska storleken på näthinnans bit från början placerad i agar. Eftersom glaskroppen förbjuder agar från helt knutna till näthinnans pjäs, kan det vara nödvändigt att göra nya hyaluronidas eller justera inkubationstiden (steg (3,3)).
4. Identifiering av den bipolära cellen synaptiska terminalen i en näthinnan skiva
- Placera retinal bit under upprätt mikroskop (t.ex. BX51WI, Olympus). Vi ser retinala skiva med infraröda kontrast differential interferens (IR-DIC) optik med en 60x vatten nedsänkning mål (NA 0,90, Olympus) och CCD-kamera (XC-75, Sony). Resultatet av den CCD-kameran skickas till en kamera controller (C2400, Hamamatsu) för kontrastförstärkning vid visualisering på en analog Sony 13 "Black och vit skärm. Mikroskopet är monterad på en XY översättning stadium, och inspelningen kammaren är placerad på en fast fas 14.
- Hitta antingen intakt och axotomized (axon-cut) bipolära cellen terminaler som kan identifieras genom sin storlek, form och position i segmentet (Figur 1). Axotomized och intakt terminaler skiljer sig också genom granskning av deras capacitative transienta nuvarande sönderfall gånger (enkel exponentiell kontra dubbel-exponentiell sönderfall, respektive) och Ca 2 + strömmar (figur 2, 12, 14, 15). Mb terminaler är belägna i de mest proximala lagret av sublamina B (ON-textlager, som gränsar till ganglion cellager) i inre plexiform lagret av guldfisk näthinnan. Mb terminaler med matt yta och platt utseende, kan lätt skiljas från ganglion och fördrivna amakrina SOMAS, som visas fas-ljus och sfäriska. Dessutom är kanten av Mb terminaler täckt med en högtäthet av synaptiska kontakter, och verkar grov och oregelbunden jämfört med släta, rena ytor ganglion och amakrina celler (Figur 1a-c). Axotomized Mb terminaler visas runt och nära cirkulär (figur 1c), medan intakt terminaler visas elliptiska och sträckte, ofta med en klämd slut pekar mot det inre nukleära lagret av näthinnan (Figur 1a, b).
- Skadade eller ohälsosamma terminaler ser ofta svullen och visa flera små korniga strukturer på ytan. Det kan vara möjligt att få en GΩ sigill på dessa terminaler, men det är troligt att brista strax efter inbrott. Andra tecken på ohälsosamt terminaler inkluderar ett ihåligt utseende, kontrast och / eller ljusstyrka identisk med den omgivande skiva, och ibland plats på ytan av segmentet. Det är möjligt att spela in både från friska terminalerna djupt i slice (fördel: mer intakt synaptic kretsar) och även nära ytan av slice (ADVantage: snabbare tillgång till perfusion droger i extern lösning, lättare att täta).
5. Elektrofysiologiska inspelningar och Ca 2 + bildbehandling
- Med hjälp av en spruta med en 0,2 ìm filter spets (Nalgene), fyll pipetten glaset plåstret med intern lösning till en nivå 1-2 centimeter från baksidan av pipetten. Efter att luftbubblor från spetsen, säkra pipetten i hållaren, tillämpa positiv tryck (1,2-1,6 bar), och flytta den mot riktade terminalen med hjälp av en mikromanipulator (MPC-200, Sutter Instrument). Medan du flyttar spetsen nedåt genom segmentet, flytta pipetten en lateral svepande riktning för att säkerställa att segmentet inte dras tillsammans med spets.
- Flytta pipettspetsen runt terminalen för att rengöra membran ytan. Skjut spetsen nedåt på kanten av terminalen för att skapa en grop (strecksatsen), och släpp det positiva trycket. Om en GΩ tätning inte utgör omedelbart ansöka lätt undertryck. Efter en GΩ sigill, växla till på cellen inspelningsläge i EPC-9 patch clamp förstärkare och ändra innehavet potential att -60 eller -70 mV. Applicera C-snabb (snabb-kapacitans) korrigering, vänta på tätningen för att stabilisera mellan 5-10 GΩ och sedan spräcka membranet med skarpa, mjuka sug tillämpas av munnen för att fastställa helcells-inspelning konfiguration. Om helcells-konfigurationen är rätt etablerad, kommer serieresistiv vara mellan 14-30 Mohm. Ingångsresistans kommer att vara 200-500 Mohm för intakt terminaler och 1-3 GΩ för axotomized terminaler 14.
- Observera kapacitiv ström övergående (Figur 2a och 2c), att skilja mellan intakta och axotomized terminaler bipolära cellen. Intakt och axotomized Mb terminaler har en kapacitans baslinje membran av 9-16 pF och 3-8 pF, respektive.
- Applicera en 200 ms varaktighet spänning-clamp steg från -70 till 0 mV till en axotomized Mb terminal. Detta gör attdirekt mätning av stora (~ 200-600 PA), isolerade inåt Ca 2 + strömmar aktiveras genom öppnandet av spänningsberoende L-typ Ca2 +-kanaler (Figur 2b). Samtidigt är en möjlighet att övervaka kapacitans hoppa orsakas av exocytos av synaptiska vesiklar, och den snabba, pH-medierad hämning av Ca 2 + ström som följer exocytos 15 och GABAergic ömsesidig respons inhibering (figur 3c, 22). Om ett plåster en intakt Mb bipolär cell terminalen blir resultatet som i figur 2c och 2d. Inga märkbara Ca 2 + strömmar observeras på grund av den stora "läcka" ström på grund av gap-junction koppling i dendriter av Mb bipolära celler 1.
- Membran kapacitansen förändringar kan framkallas av ett steg depolarisation från anläggningen potential -70 mV till 0 mV använda "sinus + DC" metod för tidsupplöst membran kapacitansmätningar 6. Membran kapacitansen hoppar ange fusion av synaptiska vesiklar med plasmamembranet. En 2 kHz sinusformad spänning-clamp kommandot (30 mV topp-till-topp) lades till innehavet potential -70 mV. Inspelningen nuvarande analyserades vid två ortogonala fas vinklar av EPC-9 patch-clamp förstärkare programvara emulering av en lock-in förstärkare (Heka, Lambrecht, Tyskland). I den intakta terminalen i figur 2d, en hög frekvens (2 kHz) sinusformad stimulans begränsar membranets kapacitans som analyseras till terminalen ändelser och axonet, som har ett Cm baseline kapacitans ~ 6,8 pF. Membranet i cellkroppen och dendriter av den bipolära cellen är därmed filtreras bort av den höga frekvensen spänning-clamp sinusvåg 13.
- För Ca 2 +-imaging experiment, blanda intern lösning plåster pipett med en Ca2 +-känsliga fluorescerande färg (t.ex. Oregon Grön 488 BAPTA-1 (100-200 mikroM, O-6806, Invitrogen)) och upprepa protokoll från 5Från 0,1 till 5,5. Detta kommer att tillåta en att kombinera fluorescens avbildning och elektrofysiologiska inspelning. Till exempel är det möjligt att bilden av Ca 2 + övergående i samband med en 200 ms steg från -70 till 0 mV i den lilla telodendria bihang av Mb terminalen (figur 3a, b). Vi har integrerat vårt upprätt Olympus mikroskop med en snurrande skiva laser konfokalmikroskop systemet (CSU-X1, Yokogawa). Den konfokalmikroskop använder 488 nm och 561 nm linjer laser som moduleras av en akusto-optisk avstämbara filter. Data som förvärvats med hjälp Slidebook programvara (3i, Intelligent Imaging instrument). För mer information om tekniker kalcium avbildning med guldfiskar näthinnans nervceller se 24, 17, 3.
Felsökning:
Om man ofta misslyckas med att etablera ett helcells-konfiguration, även efter bildandet av en stabil GΩ tätning, kan det vara bra att minska de negativa tryck som används för att punktera terminalen migmbrane. Det kan också vara så att optimalt sugtryck för inrättandet av helcells-konfiguration varierar som en funktion av membran krökning (soma> Terminal). Det är också möjligt att använda en zap protokoll (Amplitud: 400 mV, Duration: 100 uS) att gå in i helcells-konfiguration, antingen ensamt eller i kombination med en kraftig puls av undertryck. Vi har hittat ZAP-protokollet för att vara särskilt användbart för inbrott när du använder en pipettspets med badkar motstånd på över 12 Mohm.
6. Representativa resultat
Figur 1. Identifiering av Mb bipolära cellen terminaler i Goldfish retinal skivor. (AC) IR-DIC bilder av Mb bipolära cellen terminaler. Vi kan identifiera sannolika axotomized (axon-cut) och intakt terminaler i IR-DIC bild. En axotomized terminalen visas runt och runt, som visas i Cmedan en intakt terminalen är mer sannolikt att visas elliptiska, som visas i A och B. Denna klassificering kan bekräftas genom övergående kapacitans mätning (se figur 2) eller genom att färgen fyller metoden (d - f). Röda pilarna anges placeringen av skärningspunkten mellan axon och axonet terminal för den intakta terminaler i a och b. Röd streckad linje anges konturen av Mb bipolära cellen terminaler. (DF). Fluorescens bilder av Mb bipolära cellen terminaler med en intakt axon (d), en delvis skära axonet (e), eller en helt bort axonet (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) fluorescerande färg var fylld med intern lösning före inspelningen. Omedelbart efter patch-clamp inspelningen, var det retinala bit över till 4% (vikt / vol) paraformaldehyd (P6148, Sigma) i fosfatbuffertlösning (70.013, GIBCO) och inkuberas i 30min. Skivor var monterad på SuperFrost diabilder (Fisher Scientific) i vattenlösning monteringsmedium med anti-fading medel (Biomeda corp). Alexa 555 innehåller Mb bipolära cellen terminaler visades med en 555 nm laser linje (röd) med en 40x vatten nedsänkning mål om en konfokala laser-scanning mikroskop (LSM 710, Carl Zeiss). Notera förekomsten av små telodendria bihang sticker ut från axonet terminalerna (blå pilar). Skalningsfält visar 10 mikrometer (a - f). INL: inre kärnkraft lager, IPL: inre plexiform lager, GCL: ganglion cellager.
Figur 2. Elektriska egenskaper axotomized och intakt Mb bipolära cellen terminaler. (A, c) Övergående nuvarande svaret aktiveras av en spänning-clamp steg hyperpolarisering från anläggningen potential -60 mV till -70 mV. Den korta aktuella svar på en -10 mV spänning-clamp stegkan leda till: 1) en enda snabb exponentiell nuvarande sönderfall med hög ingång motstånd vid -70 mV (tecken på en axotomized terminal, panel a), eller 2) en dubbel-exponentiellt avtagande med låg ingång motstånd vid -70 mV (tecken på en intakt terminal, panel c, se även 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + strömmar och membran hoppar kapacitans var framkallade av ett steg depolarisation från -70 till 0 mV. Tidsupplöst membran kapacitansmätningar använda en 2-kHz sinusvåg stimulans ovanpå vilar hålla potential -70 mV 6. Den röda spår är det genomsnittliga värde kapacitans datapunkter. Observera att kapacitansen hoppa i figur 2b och 2d är båda lika med cirka 200 ff.
Figur 3. Direkta mätningar av Ca 2 + bildbehandling signaler, exocytos, och hämmande feedback i en Mb bipolär cell terminalen. (A) En övergående ökning av Ca 2 + koncentrationen i telodendria av en Mb terminalen aktiveras av en spänning-clamp steg depolarisation från -70 till 0 mV till 200 ms (pil). Oregon Grön 488 BAPTA-1 (100 M), en Ca 2 +-indikatorn färg, ingick i plåstret pipetten. (B) Motsvarande fluorescens bild av Mb telodendria (regionen av intresse visas med röd streckad linje). (C) Kortfristiga synaptisk depression av frisättningen av neurotransmittorer (exocytos). Ca 2 + strömmar (mitten spår) och membran kapacitans (lägre spår) framkallade av ett par 20 ms depolarizations till 0 mV (övre spår, 200 ms mellan puls intervall). Pilen visar effekten av exocytosed protoner på Ca 2 + ström och även GABAergic ömsesidig respons inhibering från närliggande amakrina celler 15, 21. Observera att proton-medierad hämning av Ca 2 + ström och även GABAergic ömsesidig feedback-hämning är närvarande endast i det första depolariserande svar, som också har en kapacitans hoppa på grund av exocytos av synaptiska blåsor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt och svårt steg i våra protokoll är överföring av del av näthinnan i agar lösningen (protokoll 3,4). Det är nödvändigt att noggrant avlägsna glaskroppen och återstående skiva lösning från retinala pjäsen och den överförs utan förvrängning eller böjning. För att åstadkomma detta använder vi en liten spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spets böjd att bilda en 90 ° vinkel, tillsammans med vinklad spets pincett (11.251-35, Fine Science Tools), att placera näthinnan bit under överföringen processen skiva lösning. Kvarvarande bit lösningen på näthinnan slice och spatel kan tas bort genom noggrann badda av yta med hörnet av ett vikas eller rullas Kimwipes (Kimberly-Clark).
Ett annat vanligt sätt att förbereda tvärgående retinal skivor är filterpappret-baserat protokoll 23. Kortfattat är en inverterad bit av hela näthinnan knutna till en rektangel bit av Millipore filter disken (gangliecell läggaER mot filterpapper, fotoreceptor lager uppåt) och skär den i 250 ìm tjocka skivor med en manuell vertikal "tumme" slicer (t.ex. Narishige ST-20). Vi finner att fördelarna med filterpapper-baserat protokoll inkluderar friskare fotoreceptorer och en ökning förhållandet axotomized på intakt Mb terminaler. Vi använder alltså denna filterpapper metod att framkalla ljus-evoked potential från enstaka Mb terminaler inbäddade i näthinnan skivor.
Fördelarna med våra agar-baserat protokoll över filtret pappers-baserat protokoll är att 1) näthinnans slice produceras är platt, jämn och relativt oskadade med tydlig åtskillnad mellan näthinnans skikt, vilket gör patchning i något inre nukleära lager eller plexiform lager retinala cell som önskas, och 2) immunohistokemi följande elektrofysiologiska inspelning sker lättare på grund av den intakta och platt geometri slice och de faktorer som nämns i punkt (1) ovan. Ett protokoll för inspelning ljus svarar av näthinnans nervceller i en agar-baserade preparat har tidigare publicerats i JUPITER 2. En horisontell näthinnan slice förberedelse som använt en kombination av agar och filter tekniker papper har också tidigare publicerats i JUPITER 5. Vi rekommenderar att titta på dessa videor i kombination med vår egen att jämföra de olika teknikerna.
Direkt tillgång till band-typ presynaptiska terminaler i ryggradsdjur näthinnan skivor ger oss möjlighet att undersöka synaptisk transmission på band-typ aktiva zoner. Det tillåter oss också att direkt studera synaptiska fysiologi i näthinnan mikrokretsar. Denna teknik kommer att vara särskilt användbart för parade inspelningar av pre-och postsynaptiska signaler, med postsynaptiska partners såsom hämmande amakrina celler och standardtillsatser ganglion celler 1, 16, 10. Kopplade inspelningar på band-typ synapser mellan råtta cochlea inre hårcellerna och afferenta dendriter är möjliga och har beskrivits av 7. Kalcium fantasing av Mb bipolära cellen terminaler har utförts i akut dissocierade celler 8 och i näthinnan skivor 17, liksom i Goldfish amakrina celler 3. Nyligen genomförda studier har visat stora förbättringar för in vivo och in vitro optogenetic metoder i transgena zebrafisk näthinnan 4. Framtida inriktningar kommer sannolikt att innebära dessa transgena tekniker, tillsammans med elektrofysiologiska metoder, som ger oss möjlighet att överbrygga gapet mellan in vitro-skiva inspelningar och in vivo imaging, i slutändan leder till beteendestudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga konkurrerande intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Fred Rieke för hans vänliga förklaring av agar inbäddade-retinal slice förberedelser när vi började använda protokollet i vårt laboratorium. Vi tackar också Lori Vaskalis för illustration av schematisk överblick och Dr. Veeramuthu Balakrishnan och Soyoun Cho för värdefulla kommentarer på texten och video. Detta arbete stöddes av ett NEI-NIH RO1 bidrag, och var också delvis av en Korea Research Foundation som finansieras av Sydkoreas regering [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
