מסורתית, שני ממדי התרבות טכניקות תא לעיתים לגרום מאפיינים שינו לגבי סמנים בידול, ציטוקינים וגורמי גדילה. תלת ממדי התרבות תאים במערכת מסתובבת תרבית תאים (RCCS) reestablishes הביטוי של רבים מהגורמים הללו כפי שמוצג כאן עם קו trophoblast extravillous התא.
תחום המחקר trophoblast אדם מסייע בהבנת סביבה מורכבת הוקמה במהלך placentation. בשל אופיו של מחקרים אלה, האדם ניסויים vivo הוא בלתי אפשרי. שילוב של תרבויות העיקרי, תרבויות explant ואת שורות תאים trophoblast 1 תמיכה הבנתנו הפלישה של קיר הרחם 2 שיפוץ של עורקי הרחם ספירלה 3,4 על ידי תאים trophoblast extravillous (EVTs), אשר נדרש להקמת מוצלח של ההריון. למרות עושר של ידע שלוקטו מודלים כאלה, מקובל כי בתרבות במבחנה מודלים התא באמצעות evt כמו שורות תאים להציג שינו תכונות הסלולר בהשוואה 5,6 ב עמיתיהם vivo שלהם. תאים בתרבית תאים של מערכת מסתובבת תרבות (RCCS) ולהציג מאפיינים מורפולוגיים, פנוטיפי, ופונקציונלי של evt כמו שורות תאים אשר באופן הדוק יותר לחקות הבחנה ב uטרו EVTs, עם ביטוי מוגבר של גנים המתווך הפלישה (למשל metalloproteinases מטריצה (MMPs)) והבחנה trophoblast 7,8,9. ג'ורג' הקדוש תא החולים שליה קו-4 (SGHPL-4) (תרם בעין יפה על ידי ד"ר גיא ויטלי וד"ר יהודית קרטרייט) הוא קו evt דמוי תא ששימש לבדיקות ב RCCS.
העיצוב של כלי השיט תרבות RCCS מבוסס על העיקרון כי איברים ורקמות לתפקד בסביבה (3-D) תלת מימדי. בשל תנאי התרבות דינמי הספינה, כולל תנאי גזירה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, התאים גדלו בשלושה ממדים בצורת אגרגטים מבוסס על זיקות הסלולר טבעי להתמיין לרקמות כמו אסיפות organotypic 10,11,12. תחזוקה של מסלול נוזל מספק נמוכה גזירה, מערבולת נמוכה בסביבה דומה לתנאים מצאו in vivo. שקיעה של תאים בתרבית הוא השיב על ידי התאמת סיבובמהירות RCCS כדי להבטיח נפילה חופשית מתמדת של תאים. גז חילופי מתרחשת דרך קרום חדיר הידרופובי הממוקם בצד האחורי של bioreactor. כמו ההורים שלהם רקמות in vivo, RCCS מבוגר תאים מסוגלים להגיב כימית והדרגות מולקולרית בשלושה ממדים (כלומר על משטחים apical, הבסיסיים, שלהם לרוחב) כי הם תרבותי על פני השטח של חרוזים microcarrier נקבובי. כאשר גדל כמו דו מימדי monolayers על משטחים בלתי חדיר כמו פלסטיק, תאים נשללת של תקשורת חשוב זה על פני השטח הבסיסי שלהם. כתוצאה מכך, המגבלות שהוטלו על ידי מרחבית בסביבה מאוד להשפיע על האופן שבו תאים תחושת אותות לפענח מתוך microenvironment שמסביב, ובכך רומז תפקיד חשוב עבור המילייה 3-D 13.
השתמשנו RCCS מהנדס משמעות ביולוגית 3-D מודלים שונים של רקמות אפיתל האנושי 7,14,15,16. ואכן, דוחות קודמים רבים demonstrated כי תאים בתרבית RCCS יכול להניח פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה לא היה אפשרי עם דגמים אחרים 10,17-21. לסיכום, תרבות RCCS מייצגת קל, לשחזור, תפוקה גבוהה פלטפורמה המספקת כמויות גדולות של תאים מובחנים זה ניתנים מגוון רחב של מניפולציות ניסיוני. בפרוטוקול הבא, באמצעות EVTs כדוגמה, אנו בבירור לתאר את הצעדים הנדרשים כדי בתלת ממד תאים תרבות חסיד ב RCCS.
הטכניקה המוצגת כאן תרבות מספק החוקרים עם evt דמויי תאים פולשני מאוד. זה עתה הכיר בכך הפסד של בידול מתרחשת monolayers בשל עיכוב של תגובות כימיות הסלולר אותות מולקולריים בשלושה ממדים (משטחים התא apical, הבסיסיים, לרוחב) 10,13. טכניקה זו משקפת מאפיינים ציין ברחם על הפולשי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני הלאומי לבריאות NIH מענק / NICHD # HD051998 (עד רמ"א).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
FBS | Invitrogen | 10437 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |