Traditionell, tvådimensionell cellodling tekniker leder ofta till förändrade egenskaper vad gäller differentiering markörer, cytokiner och tillväxtfaktorer. Tredimensionella cellodling i roterande cellodlingssystem (RCC) återupprättar uttrycket av många av dessa faktorer så som visas här med en extravillous trofoblasten cellinje.
Området mänskliga trofoblasten forskning hjälpmedel för att förstå den komplexa miljö som fastställdes under placentation. På grund av karaktären av dessa studier, är det mänskliga in vivo experiment omöjligt. En kombination av primära kulturer, kulturer Explantation och trofoblasten cellinjer 1 bidra till vår förståelse invasion av livmoderväggen 2 och ombyggnad av livmodern spiral artärer 3,4 av extravillous trofoblasten celler (EVTs), som krävs för en lyckad etablering av graviditeten. Trots den mängd kunskap som samlats in från sådana modeller, är det accepterat att in vitro-modeller cellodling med hjälp av EVT-liknande cellinjer display ändras cellulära egenskaper jämfört med de in vivo motsvarigheter 5,6. Celler odlade i roterande cellodlingssystem (RCC) display morfologiska, fenotypiska och funktionella egenskaper EVT-liknande cellinjer som närmare efterliknar differentiera i UTero EVTs, med ökat uttryck av gener förmedla invasion (t.ex. metalloproteinaser (MMPs)) och trofoblasten differentiering 7,8,9. Saint Georges Hospital placenta cellinje-4 (SGHPL-4) (vänligt donerad av Dr Guy Whitley och Dr Judith Cartwright) är en EVT-liknande cellinje som användes för att testa i RCC.
Utformningen av RCC kulturen fartyget bygger på principen att organ och vävnader fungerar i en tredimensionell (3-D) miljö. På grund av den dynamiska kulturen förutsättningar i fartyget, inklusive villkor för fysiologiskt relevant sax, celler som odlas i tre dimensioner bildar aggregat bygger på naturliga cellulära tillhörighet och differentierar till organotypic vävnad-liknande församlingar 10,11,12. Upprätthållandet av en vätska bana ger en låg skjuvning, låg turbulens miljö som liknar förhållandena i vivo. Sedimentation av de odlade cellerna motverkas genom att justera rotationenhastigheten för RCC att säkerställa en konstant fritt fall av celler. Gasutbyte sker genom en genomsläpplig hydrofobt membran på baksidan av bioreaktor. Liksom deras föräldrar vävnad in vivo, RCC-odlade celler kan svara på kemiska och molekylära gradienter i tre dimensioner (dvs på deras apikala, basala och laterala ytor) eftersom de är odlade på ytan av porösa microcarrier pärlor. När odlas som tvådimensionella monolager på ogenomträngliga ytor som plast, celler berövas denna viktiga kommunikation på sina basala yta. Följaktligen rumsliga begränsningar som miljön påverkar djupt hur celler förnuft och signaler avkoda från den omgivande mikromiljö, vilket innebär en viktig roll för 3-D miljö 13.
Vi har använt RCC att konstruera biologiskt meningsfulla 3-D-modeller av olika mänskliga epitelvävnader 7,14,15,16. Faktum är att många tidigare rapporter har markonstrated att celler odlade i RCC kan anta fysiologiskt relevanta fenotyper som inte har varit möjligt med andra modeller 10,17-21. Sammanfattningsvis representerar kultur i RCC ett enkelt, reproducerbar, high-throughput plattform som ger ett stort antal differentierade celler som kan bli föremål för en mängd olika experimentella manipulationer. I följande protokoll, med EVTs som exempel beskriver vi tydligt de steg som krävs för att tredimensionellt kultur anhängare celler i RCC.
Kulturen Tekniken som presenteras här ger utredarna med mycket invasiva EVT-liknande celler. Det har nu erkänt att en förlust av differentiering förekommer i monolager grund av hämning av cellulära svaren på kemiska och molekylära signaler i tre dimensioner (apikala, basala och laterala cellytan) 10,13. Denna teknik speglar egenskaper som noterats i livmodern på invaderande EVT celler. Eftersom förfarandet härmar konventionella cellslager vävnad kinetik kultur tiden, men ger celler med di…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag NIH / NICHD # HD051998 (till CAM).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
FBS | Invitrogen | 10437 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |