Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

Summary

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Abstract

Het gebied van human trofoblast onderzoek helpt bij het begrijpen van de complexe omgeving die tijdens placentatie. Vanwege de aard van deze studies, de mens in vivo experimenten is onmogelijk. Een combinatie van primaire culturen, Explantatie culturen en trofoblast cellijnen ^een ondersteuning van ons begrip van de invasie van de baarmoederwand ² en vermaken van de baarmoeder spiraalvormige arteriën ^3,4 door extravillous trofoblast cellen (EVTS), die nodig is voor een succesvolle invoering van de zwangerschap. Ondanks de rijkdom aan kennis uit dergelijke modellen, wordt aanvaard dat in vitro celcultuur modellen met EVT-achtige cellijnen weer te geven cellulaire eigenschappen veranderd in vergelijking met hun tegenhangers in vivo ^5,6. Cellen gekweekt in de roterende celkweek systeem (RCC's) display morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen van de EVT-achtige cellijnen die beter na te bootsen onderscheid in uTero EVTS, met een verhoogde expressie van genen bemiddelen invasie (bijv. matrix (MMP's)) en trophoblast differentiatie ^7,8,9. De Saint Georges Hospital placenta cellijn-4 (SGHPL-4) (vriendelijk geschonken door dr. Guy Whitley en Dr Judith Cartwright) is een EVT-achtige cellijn die werd gebruikt voor het testen in het RCC.

Het ontwerp van de RCC's cultuur schip is gebaseerd op het principe dat organen en weefsels functie in een drie-dimensionale (3-D)-omgeving. Door de dynamische cultuur omstandigheden in de tank, met inbegrip van voorwaarden van fysiologisch relevante shear, cellen gekweekt in drie dimensies vorm aggregaten op basis van natuurlijke cellulaire affiniteiten en differentiëren naar organotypische weefsel-achtige samenstellingen ^10,11,12. Het onderhoud van een vloeistof baan zorgt voor een low-shear, lage turbulentie omgeving die lijkt op omstandigheden in vivo. Sedimentatie van de gekweekte cellen wordt tegengegaan door het aanpassen van de rotatiesnelheid van de RCC's om een ​​constante vrije val van de cellen te verzekeren. Gasuitwisseling gebeurt door middel van een permeabel membraan hydrofoob zich aan de achterkant van de bioreactor. Net als hun ouders weefsel in vivo, RCC volwassen cellen zijn in staat om chemische en moleculaire gradiënten reageren in drie dimensies (dat wil zeggen op hun apicale, basale en laterale oppervlakken), omdat ze worden gekweekt op het oppervlak van de poreuze microdrager kralen. Wanneer ze groeien als twee-dimensionale monolagen op ondoordringbare oppervlakken, zoals plastic, worden de cellen verstoken van deze belangrijke communicatie op hun basale oppervlak. Derhalve zijn de ruimtelijke beperkingen die worden opgelegd door de omgeving diepgaand invloed hebben op hoe cellen zin en decoderen signalen van de omringende micro-omgeving, dus impliceren een belangrijke rol voor de 3-D milieu ^13.

We hebben de RCC's om biologisch zinvolle 3-D modellen van de verschillende menselijke epitheelweefsels ^7,14,15,16 ingenieur. Inderdaad, veel eerdere rapporten demook aangetoond dat cellen gekweekt in de RCC kan fysiologisch relevante fenotypen die niet mogelijk was geweest met de andere modellen ^10,17-21 nemen. Kortom, cultuur in de RCC is een eenvoudige, reproduceerbare, high-throughput platform dat een groot aantal van gedifferentieerde cellen die vatbaar zijn voor een aantal experimentele manipulaties biedt. In het volgende protocol, met behulp van EVTS als een voorbeeld hebben we een duidelijke beschrijving van de stappen die nodig zijn om driedimensionaal cultuur hechtende cellen in het RCC.

Protocol

1. Collageen Bead Voorbereiding Voorafgaand aan het laden van EVTS voor 3-D celkweek, moet men de voorbereiding van de Cytodex-3 microdrager kralen: Weeg de juiste hoeveelheid van Cytodex-3 kralen die nodig zijn voor het experiment. Dit protocol is aangepast voor de 10 ml RCC's schip, waarbij 0,05 g van kralen nodig zijn. Voor een 50 ml RCC's schip, overeenkomstig schaal. In een 50ml autoclaveerbaar conische buis, 250 mg Cytodex-3 kralen mengen met 12ml Dulbecco fosfaatgebufferde oplossing (D…

Discussion

De cultuur hier gepresenteerde techniek biedt onderzoekers met zeer invasieve EVT-achtige cellen. Het is nu erkend dat een verlies van differentiatie optreedt in monolagen als gevolg van remming van de cellulaire reacties op chemische en moleculaire signalen in drie dimensies (apicale, basale en laterale celoppervlak) ^10,13. Deze techniek geeft de kenmerken vermeld in de baarmoeder op de binnenvallende EVT cellen. Aangezien de procedure nabootst conventionele monolaag weefselkweek tijd kinetiek, maar…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140