Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Summary

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Abstract

O campo de pesquisa trofoblasto humano ajuda na compreensão do ambiente complexo estabelecido durante placentação. Devido à natureza destes estudos, humanos em experimentação in vivo é impossível. A combinação de culturas primárias, as culturas de explante e linhas de células do trofoblasto ^um auxiliar para a compreensão de invasão da parede uterina ² e remodelação das artérias uterinas espiral ^3,4 por células do trofoblasto extravilosas (TEVs), que é necessário para o estabelecimento de sucesso da gravidez. Apesar da riqueza de conhecimentos provenientes de tais modelos, aceita-se que em modelos de células in vitro utilizando linhas cultura EVT-como célula de exibição alterado propriedades celular quando comparados com os seus homólogos em ^5,6 vivo. Células cultivadas em sistema de rodízio de cultura de células (CCRs) exibir as propriedades morfológicas, fenotípicas e funcionais de linhas de EVT-como célula que mais perto imitar diferenciar em uTEVs Tero, com aumento da expressão de genes de mediação invasão (por exemplo metaloproteinases de matriz (MMPs)) e diferenciação do trofoblasto ^7,8,9. O Hospital Saint Georges de células placentária Linha-4 (SGHPL-4) (gentilmente doado pelo Dr. Guy Whitley e Judith Dr. Cartwright) é uma linha de células EVT-like que foi usado para testes no CCRs.

O design do navio cultura RCCs é baseado no princípio de que órgãos e tecidos em função de uma imagem tridimensional do ambiente (3-D). Devido às condições de cultura dinâmica no reservatório, incluindo as condições de cisalhamento fisiologicamente relevantes, as células cultivadas em três dimensões formam agregados com base em afinidades naturais celular e se diferenciar em tecido organotípicas-like assembléias ^10,11,12. A manutenção de uma órbita de fluido proporciona um baixo cisalhamento, o ambiente de turbulência de baixa semelhante às condições encontradas in vivo. Sedimentação das células cultivadas for anulada, ajustando a rotaçãovelocidade do CCRs para assegurar uma constante queda livre de células. Troca de gases ocorre através de uma membrana permeável hidrofóbica localizado na parte traseira do biorreator. Como seus pais tecido in vivo, CCRs de produção de células são capazes de responder a química molecular e gradientes em três dimensões (ou seja, suas superfícies apical, basal e lateral), porque eles são cultivadas na superfície dos grânulos microcarregador poroso. Quando cultivada como bidimensional monocamadas em superfícies impermeáveis, como o plástico, as células são privados dessa comunicação importante em sua superfície basal. Conseqüentemente, as restrições espaciais impostas pelo ambiente afetam profundamente sentido como células e decodificar sinais do microambiente em torno, o que implica um papel importante para o meio 3-D ^13.

Temos usado a CCRs para engenheiro biologicamente significativas modelos 3-D de vários tecidos epiteliais humanas ^7,14,15,16. De fato, muitos relatórios anteriores demtrada que as células cultivadas em CCRs pode assumir fenótipos fisiologicamente relevantes que não foram possíveis com outros modelos ^10,17-21. Em resumo, a cultura na RCCs representa uma tarefa fácil, reprodutível, plataforma de alto rendimento que proporciona um grande número de células diferenciadas que são passíveis de uma variedade de manipulações experimentais. No protocolo a seguir, usando TEVs como exemplo, que descrevem claramente os passos necessários para as células de forma tridimensional de cultura aderente na CCRs.

Protocol

1. Preparação de colágeno Bead Antes de TEVs carregamento para 3-D de cultura de células, é preciso preparar as contas Cytodex-3 microcarregador: Pesar a quantidade adequada de Cytodex-3 contas necessárias para o experimento. Este protocolo é adaptado para o navio RCCs 10ml, em que 0,05 g de contas são necessários. Para que um navio RCCs 50ml, escala em conformidade. Em um tubo de 50 ml autoclavável cônica, misturar 250 mg Cytodex-3 contas com 12 ml de fosfato tamponada Dulbecco (DPBS). Es…

Discussion

A técnica de cultura aqui apresentada fornece aos investigadores altamente invasivo EVT células semelhantes. Ele já foi reconhecido que a perda de diferenciação ocorre em monocamadas devido à inibição da resposta celular a agentes químicos e sinais moleculares em três dimensões (superfícies celulares apical, basal e lateral) ^10,13. Esta técnica reflete características observou in utero invadir células EVT. Como o procedimento imita convencionais monocamada tecido cinética de tempo da …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140