Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.
O campo de pesquisa trofoblasto humano ajuda na compreensão do ambiente complexo estabelecido durante placentação. Devido à natureza destes estudos, humanos em experimentação in vivo é impossível. A combinação de culturas primárias, as culturas de explante e linhas de células do trofoblasto um auxiliar para a compreensão de invasão da parede uterina 2 e remodelação das artérias uterinas espiral 3,4 por células do trofoblasto extravilosas (TEVs), que é necessário para o estabelecimento de sucesso da gravidez. Apesar da riqueza de conhecimentos provenientes de tais modelos, aceita-se que em modelos de células in vitro utilizando linhas cultura EVT-como célula de exibição alterado propriedades celular quando comparados com os seus homólogos em 5,6 vivo. Células cultivadas em sistema de rodízio de cultura de células (CCRs) exibir as propriedades morfológicas, fenotípicas e funcionais de linhas de EVT-como célula que mais perto imitar diferenciar em uTEVs Tero, com aumento da expressão de genes de mediação invasão (por exemplo metaloproteinases de matriz (MMPs)) e diferenciação do trofoblasto 7,8,9. O Hospital Saint Georges de células placentária Linha-4 (SGHPL-4) (gentilmente doado pelo Dr. Guy Whitley e Judith Dr. Cartwright) é uma linha de células EVT-like que foi usado para testes no CCRs.
O design do navio cultura RCCs é baseado no princípio de que órgãos e tecidos em função de uma imagem tridimensional do ambiente (3-D). Devido às condições de cultura dinâmica no reservatório, incluindo as condições de cisalhamento fisiologicamente relevantes, as células cultivadas em três dimensões formam agregados com base em afinidades naturais celular e se diferenciar em tecido organotípicas-like assembléias 10,11,12. A manutenção de uma órbita de fluido proporciona um baixo cisalhamento, o ambiente de turbulência de baixa semelhante às condições encontradas in vivo. Sedimentação das células cultivadas for anulada, ajustando a rotaçãovelocidade do CCRs para assegurar uma constante queda livre de células. Troca de gases ocorre através de uma membrana permeável hidrofóbica localizado na parte traseira do biorreator. Como seus pais tecido in vivo, CCRs de produção de células são capazes de responder a química molecular e gradientes em três dimensões (ou seja, suas superfícies apical, basal e lateral), porque eles são cultivadas na superfície dos grânulos microcarregador poroso. Quando cultivada como bidimensional monocamadas em superfícies impermeáveis, como o plástico, as células são privados dessa comunicação importante em sua superfície basal. Conseqüentemente, as restrições espaciais impostas pelo ambiente afetam profundamente sentido como células e decodificar sinais do microambiente em torno, o que implica um papel importante para o meio 3-D 13.
Temos usado a CCRs para engenheiro biologicamente significativas modelos 3-D de vários tecidos epiteliais humanas 7,14,15,16. De fato, muitos relatórios anteriores demtrada que as células cultivadas em CCRs pode assumir fenótipos fisiologicamente relevantes que não foram possíveis com outros modelos 10,17-21. Em resumo, a cultura na RCCs representa uma tarefa fácil, reprodutível, plataforma de alto rendimento que proporciona um grande número de células diferenciadas que são passíveis de uma variedade de manipulações experimentais. No protocolo a seguir, usando TEVs como exemplo, que descrevem claramente os passos necessários para as células de forma tridimensional de cultura aderente na CCRs.
A técnica de cultura aqui apresentada fornece aos investigadores altamente invasivo EVT células semelhantes. Ele já foi reconhecido que a perda de diferenciação ocorre em monocamadas devido à inibição da resposta celular a agentes químicos e sinais moleculares em três dimensões (superfícies celulares apical, basal e lateral) 10,13. Esta técnica reflete características observou in utero invadir células EVT. Como o procedimento imita convencionais monocamada tecido cinética de tempo da …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health EUA conceder NIH / NICHD # HD051998 (para CAM).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
FBS | Invitrogen | 10437 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |