Roterande Cell Culture System för mänskliga Cell Culture: Mänskliga trofoblasten Celler som modell

Summary

Traditionell, tvådimensionell cellodling tekniker leder ofta till förändrade egenskaper vad gäller differentiering markörer, cytokiner och tillväxtfaktorer. Tredimensionella cellodling i roterande cellodlingssystem (RCC) återupprättar uttrycket av många av dessa faktorer så som visas här med en extravillous trofoblasten cellinje.

Abstract

Området mänskliga trofoblasten forskning hjälpmedel för att förstå den komplexa miljö som fastställdes under placentation. På grund av karaktären av dessa studier, är det mänskliga in vivo experiment omöjligt. En kombination av primära kulturer, kulturer Explantation och trofoblasten cellinjer ¹ bidra till vår förståelse invasion av livmoderväggen ² och ombyggnad av livmodern spiral artärer ^3,4 av extravillous trofoblasten celler (EVTs), som krävs för en lyckad etablering av graviditeten. Trots den mängd kunskap som samlats in från sådana modeller, är det accepterat att in vitro-modeller cellodling med hjälp av EVT-liknande cellinjer display ändras cellulära egenskaper jämfört med de in vivo motsvarigheter ^5,6. Celler odlade i roterande cellodlingssystem (RCC) display morfologiska, fenotypiska och funktionella egenskaper EVT-liknande cellinjer som närmare efterliknar differentiera i UTero EVTs, med ökat uttryck av gener förmedla invasion (t.ex. metalloproteinaser (MMPs)) och trofoblasten differentiering ^7,8,9. Saint Georges Hospital placenta cellinje-4 (SGHPL-4) (vänligt donerad av Dr Guy Whitley och Dr Judith Cartwright) är en EVT-liknande cellinje som användes för att testa i RCC.

Utformningen av RCC kulturen fartyget bygger på principen att organ och vävnader fungerar i en tredimensionell (3-D) miljö. På grund av den dynamiska kulturen förutsättningar i fartyget, inklusive villkor för fysiologiskt relevant sax, celler som odlas i tre dimensioner bildar aggregat bygger på naturliga cellulära tillhörighet och differentierar till organotypic vävnad-liknande församlingar ^10,11,12. Upprätthållandet av en vätska bana ger en låg skjuvning, låg turbulens miljö som liknar förhållandena i vivo. Sedimentation av de odlade cellerna motverkas genom att justera rotationenhastigheten för RCC att säkerställa en konstant fritt fall av celler. Gasutbyte sker genom en genomsläpplig hydrofobt membran på baksidan av bioreaktor. Liksom deras föräldrar vävnad in vivo, RCC-odlade celler kan svara på kemiska och molekylära gradienter i tre dimensioner (dvs på deras apikala, basala och laterala ytor) eftersom de är odlade på ytan av porösa microcarrier pärlor. När odlas som tvådimensionella monolager på ogenomträngliga ytor som plast, celler berövas denna viktiga kommunikation på sina basala yta. Följaktligen rumsliga begränsningar som miljön påverkar djupt hur celler förnuft och signaler avkoda från den omgivande mikromiljö, vilket innebär en viktig roll för 3-D miljö ^13.

Vi har använt RCC att konstruera biologiskt meningsfulla 3-D-modeller av olika mänskliga epitelvävnader ^7,14,15,16. Faktum är att många tidigare rapporter har markonstrated att celler odlade i RCC kan anta fysiologiskt relevanta fenotyper som inte har varit möjligt med andra modeller ^10,17-21. Sammanfattningsvis representerar kultur i RCC ett enkelt, reproducerbar, high-throughput plattform som ger ett stort antal differentierade celler som kan bli föremål för en mängd olika experimentella manipulationer. I följande protokoll, med EVTs som exempel beskriver vi tydligt de steg som krävs för att tredimensionellt kultur anhängare celler i RCC.

Protocol

1. Kollagen Bead Förberedelser

1. Före lastning EVTs för 3-D cellodling, behöver man förbereda Cytodex-3 microcarrier pärlor:
   1. Väg upp lämplig mängd Cytodex-3 pärlor som krävs för försöket. Detta protokoll är anpassad för 10ml samhällskårer fartyget, i vilka 0.05g av pärlor behövs. För en 50ml RCC fartyg, skala därefter. I ett 50mL autoklaverbara koniskt rör, blanda 250 mg Cytodex-3 pärlor med 12ml Dulbecco fosfatbuffrad lösning (DPBS). Detta belopp är tillräckligt för 5 RCC fartyg.
2. Sörj för tillräcklig volym finns i koniska röret, som autoklaven processen kommer att resultera i avdunstning. Löst lock röret och autoklav i 10 min vid 110 ° C.
3. Ta bort den koniska röret vid slutförandet av autoklav cykeln och låt Cytodex-3 pärla lösningen svalna.
4. Efter den koniska röret svalnat till rumstemperatur, använd steril teknik för att få den totala volymen till 12,5 ml med 1X DPBS.
5. Cap och lagra beredd Cytodex-3 pärlor i rumstemperatur. Låt beredd pärlor att svälla och svalna till rumstemperatur före användning. Ovanstående beredning av Cytodex-3 pärlor kommer att sörja för fem 10mL RCC fartyg. Vi har konstaterat att utökad lagring av Cytodex-3 pärlor i rumstemperatur kommer att resultera i minskad prestanda, eftersom kollagen kommer att destabilisera efter ungefär en månad. Cytodex-3 pärlor varierar i storlek från 133 till 215 ìm.

2. Media Förberedelser

1. Förbered 1L RCC optimerade GTSF-2 media (anpassad från ^22), som består av 40% MEM alfa, plus tillägg och 60% L-15 Leibovitz media (anpassad från ^22). Först förbereder 400ml i totala volymen av MEM alfa kompletteras med:
   21.2mM natriumbikarbonat
   0,06% pepton
   0.7mm Fruktos
   1,4 mm Galaktos
   5.6mm Glukos
   1% HEPES
   1% L-glutamin
   0,5% DESS
   10% FBS

2. För att bereda en stamlösning av ITS, lös upp i 5 ml sterilt syrad H ₂ O beredd genom tillsats av isättika (ca 0,05 ml). Swirl att lösa upp, följ upp med 45 ml sterilt vatten.
3. Väg ut tillräckligt L-15 Leibovitz är pulver för 600ml av medium genom att upplösa i vävnad-kulturen klass H ₂ O.
4. Ta med den totala volymen av cellkulturmedium att 1L med L-15 Leibovitz på medellång. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C i mörker. Tillsätt 1% penicillin-streptomycin individuellt för varje alikvot av medium som används.
5. Många medier formuleringar än GTSF-2 media har framgångsrikt testats i RCC. Individuella laboratorier måste själva bestämma vilket medium som är optimal för experimentet utförs.

3. Celler och Bead Inkubation

1. Propagera EVTs till ~ 80% confluency, trypsinize och räkna med god cellkultur.
2. Häng 1x10 ⁶ EVTs i 4ml av varmED medier.
3. Blanda försiktigt beredd Cytodex-3 pärlor. Använda sterila tekniker, ta 2,5 ml av beredd pärlor med en bred spets, 10mL serologisk pipett och för över till en oanvänd 15ml koniska rör. Observera att det kan finnas en liten förlust av pärlor som de fäster vid de pipetten.
4. Låt Cytodex-3 pärlor att bosätta sig på botten av röret. Efter sedimentering, använd en pipett för att ta bort det översta lagret av DPBS utan att störa Cytodex-3 pärlor.
5. Blanda 1x10 ⁶ beredd EVTs i media med det färdiga Cytodex-3 pärlor.
6. Inkubera cell-pärla blandning vid rumstemperatur i 30 min. Periodvis blanda försiktigt. Inkubera under ytterligare 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO _2. Periodvis blanda försiktigt.

4. Fylla på RWV

1. I ett laminärt flöde skåp, ta bort en 10mL kårer ur förpackningen och placera den i en steril, 6-samt kultur plåt för stabilitet. Se figur 1 för en märkt bild av RCCS.
2. Ta bort den stora proppen från hamnen.
3. Att den totala mängden av inkubationstiden cell-pärla blandningen 10mL med varm media.
4. Ladda cellen / pärlan-blandningen i RCC genom stora porten. Den RCC bör lutas i 45 ° vinkel (stor hamn upp) när du fyller på för att avlägsna potentiella luftbubblor. Förhindra uppbyggnaden av övertryck genom att fylla fartyget långsamt och stadigt.
5. Sätt tillbaka proppen i den stora hamnen.
6. Ta bort kolvarna från 3-ml sprutor och placera den tomma sprutor på små hamnar. Tillsätt 1-3 ml av media till varje spruta. Öppna långsamt två ventiler. Byt sprutkolvarna på sprutor försiktigt. Lägg till media från en spruta tills alla bubblor avlägsnas inifrån kammaren.
7. Plocka upp kårer och knacka försiktigt på sidan när du roterar den framför dig leta efter bubblor. Om det finns några bubblor, måste du få dem ut ur kammaren, eftersom luftbubblor stör bildandet of cellaggregat och införa skjuvkrafter. Ta bort bubblorna genom att vrida på RCC tills bubblorna är under den lilla hamnen. Tryck sedan försiktigt ned sprutan på motsatt sida för att tvinga bubblor i porten och ut ur kammaren.
8. Stäng ena sidan porten. Tryck försiktigt ner på andra sprutan kolven att införa en liten mängd övertryck i kärlet, vilket förhindrar att bubblor bildas. Stäng andra ventilen.
9. Ladda RCC på rotorn. Starta rotation på 19rpm i ett 37 ° C CO ₂ inkubator.

5. Ändra media

1. Ändra media varannan dag under de tre första dagarna, därefter var dag därefter.
2. Stäng av rotorn och ta bort RCC. Dra kolvarna upp för att skapa något sug, ta bort sprutorna från varje liten hamn och placera kårer på en vinkel så att kulorna lösa motsatsen till den stora porten.
3. När kulorna har alla avgjorts, öppna en av de små ventiler ochtillåta media att flöda ut ur kårer och in i en avfallsbehållare. Ta bort 2 / 3 av media på detta sätt. Var noga med att inte störa pärlor och att inte kasta något aggregat.
4. Stäng den lilla ventilen och öppna den stora porten. Lägg till media tillbaka in i RCC genom stora porten. Sätt tillbaka proppen i den stora hamnen.
5. Upprepa steg från 4,6 till 4,9.
6. Som aggregat ökar i storlek, måste du öka rotationshastigheten att hålla dem i suspension hela tiden, helst i en liten cirkulations mönster med optimalt varvtal. Generellt ökar hastigheten mellan 0,3-0,7 varv efter varje matning när aggregaten börjar växa synbart.

6. Samla odlat celler

1. Ta bort RCC från rotorn. Ta bort sprutorna från varje liten hamn och placera kårer på en vinkel så att kulorna får lösa motsatsen till den stora porten.
2. När kulorna har alla avgjorts, öppna en av de små ventiler och låt media att rinna utav RCC och in i en avfallsbehållare. Ta bort 1 / 3 av media på detta sätt.
3. Stäng den lilla ventilen och öppna den stora porten. Snurra försiktigt på fartyget för att skingra aggregat tillbaka till lösning. Tomma flytande blandning i en steril 50 ml koniska rör. Låt den insamlade aggregat att bosätta sig i den koniska röret innan du använder supernatanten att grundligt tvätta kultur fartyget för att maximera återvinning av aggregat. De aggregat som kan användas för efterföljande analyser omedelbart, såsom flödescytometri, analyser invasion, immunofluorescens och andra.

7. Representativa resultat

Ett exempel på EVT-liknande celler (SGHPL-4 trofoblaster cellinje) odlas i kårer på Cytodex-3 pärlor visas i figur 2. I EVT-liknande cellinje visar prognoser sträcker sig bort från de största klustret och är knutna till angränsande kluster. Många av pärlorna är helt täckta med förökningsmaterial celler. När bort från RCC och PLATed på en extracellulär matris, EVT-liknande 3-D vuxit celler invaderar aggressivt och / eller migrera (Figur 3). RT-PCR uppgifterna bekräftar den ökade uttrycket av MMPs ses i 3-D aggregaten i motsats till traditionella monolager cellkultur (Figur 4). Intressant är gener inte associerade med invasionen också uppregleras i RCC (tabell 1) och får stöd i avgränsa områden som immun interaktioner med invaderande trophoblasts celler.

Figur 1. Tecknad skildring av Roterande cellodlingssystem (RCC).

Figur 2. Faskontrast mikroskop av en representativ sammanlagd efter 5 dagar tillväxt i en RCC. Pilar indikerar invaderande celler och * betecknar Cytodex-3 microcarrier pärlor.

Figur 3. RCC Grown aggregat var inbäddade i fibrin geler. Invasion via fibrin gelen observerades så tidigt som (A) 24 timmar efter fibrin inbäddning och (B) fortsatte under 48 timmar. Pilar indikerar invaderande celler och * betecknar Cytodex-3 microcarrier pärlor (anpassad, med tillstånd, från Ref. 7).

Figur 4. Jämförande gelatin zymogram av cellslager och kårer propagerade SGHPL-4 EVT-liknande celler. Pro-och aktiva former av MMP-2 och MMP-9 var som utsöndras av växt RCC trofoblasten celler (anpassad, med tillstånd, från Ref. 7).

Tabell 1. Sammanställning av microarray resultat från SGHPL-4 celler odlas i ett RCC (anpassad, med tillstånd, från Ref. 7).

1. Anger gener som låg under detektionsgränsen i monolager.

Discussion

Kulturen Tekniken som presenteras här ger utredarna med mycket invasiva EVT-liknande celler. Det har nu erkänt att en förlust av differentiering förekommer i monolager grund av hämning av cellulära svaren på kemiska och molekylära signaler i tre dimensioner (apikala, basala och laterala cellytan) ^10,13. Denna teknik speglar egenskaper som noterats i livmodern på invaderande EVT celler. Eftersom förfarandet härmar konventionella cellslager vävnad kinetik kultur tiden, men ger celler med differentierade uttryck, kan jämförande analyser användas. Cell kluster kan skördas för att användas i experiment som helst. De kan användas som kluster eller kollagen nedbrytning kan användas för att isolera celler som enda cell suspension. Den Cytodex-3 microcarrier pärlor kan ersättas med stödstrukturer eller pärlor microcarrier belagd med andra extracellulära matriser (ECM) som kan vara mer gynnsam för enskilda laboratoriernas specifika intressen. Alternattivt, det finns många andra 3D-kultur-plattformar som kan vara mer gynnsam för specifika kultur celltyp villkor, som skär cellkultur och spinner flaskor ^10,23. Det bör noteras att kultur kinetik kan bli annorlunda under dessa omständigheter och bör fastställas separat. Kultur kinetik lätt kan testas för genom att ta bort prover från kårer med jämna mellanrum och analysera för uttryck särskiljningsförmåga differentiering markörer, spridning och överlevnad ^15. Optimal spridning och kinetik differentiering kan fastställas genom att jämföra resultat över tid och mot konventionella cellslager vävnadskultur tekniker. Använda SGHPL-4 celler som ett exempel, var aggregat bort dagligen och färgas med Ki67 (för att fastställa spridning) och caspase-3 (för att avgöra apoptos), markörer som är specifika för de enskilda laboratorierna intressen kan lätt bytas ut. Tekniken beskrivs här kan användas för att studera av spiral artärombyggnad, grunda implantation, och moderns immunsvar mot invaderande trophoblasts celler.

Som har publicerats tidigare, kan detta 3-D cellodling modell även användas för en rad andra cellinjer ^17,14-21. I varje fall har nytta av modellen som ska testas av en mängd kända differentiering markörer. Liksom alla cellodling in vitro modell, 3-D cellkulturer är i sig reduktionistiskt. Ingen enskild kultur modell kommer att ge alla de mekanistiska detaljerna, men när de kombineras med publicerade resultat från andra modeller, 3D-kulturer blir en extra värdefullt alternativ modell för att förbättra vår förståelse av sjukdomsrelaterade mekanismer som kan hålla en enorm potential för utveckling av nya produkter och förfaranden för diagnos, prevention och behandling av infektionssjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD Biosciences	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD Biosciences	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher Scientific	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140