Summary

Protokoll för vaginal Inokulation och Provtagning i den experimentella musmodell av Candida Vaginit

Published: December 08, 2011
doi:

Summary

Viktiga tekniker som ska användas vid utvärdering av<em> Candida</em> Vaginit i en experimentell djurmodell beskrivs. De metoder som möjliggör snabb insamling av vaginala prover och lymfocyter från dränerande ländryggen lymfkörtlar. Dessa tekniker kan ge upphov till musmodeller av andra sjukdomar i det kvinnliga nedre könsorgan.

Abstract

Vulvovaginal candidiasis (VVC), orsakade av Candida arter är en svampinfektion i nedre kvinnliga könsorgan som drabbar cirka 75% av i övrigt friska kvinnor under reproduktiva åren 18,32-34. Predisponerande faktorer inkluderar antibiotikaanvändning, okontrollerad diabetes och störning i reproduktiv hormonnivåerna på grund av graviditet, p-piller eller hormonbehandling substitutionsbehandlingar 33,34. Återkommande VVC (RVVC), definieras som tre eller flera episoder per år, drabbar en separat 5 till 8% av kvinnor med inga faktorer 33.

En experimentell musmodell av VVC har fastställts och använts för att studera patogenesen och slemhinnor värd reaktion på Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Denna modell har också använts för att testa potentiella antimykotisk behandling in vivo 13,24. Modellen förutsätter att djuren hållas i ett tillstånd av pseudoestrus för optimal Candida kolonisering / infektion 6,14,23. Under sådana förutsättningar kommer inokuleras djur har detekterbara vaginal svamp börda i veckor till månader. Tidigare studier visar en extremt hög parallell mellan djurmodell och infektion hos människor i förhållande till immunologiska och fysiologiska egenskaper 3,16,21. Skillnader ingår dock en brist på Candida som normal vaginal flora och ett neutralt vaginalt pH i möss.

Här visar vi en rad viktiga metoder i musen vaginit modell som inkluderar vaginala ympning, snabb samling av vaginala prover, bedömning av vaginal svamp börda, och förberedelser vävnad för cellulära utvinning / isolering. Detta följs av representativa resultat för beståndsdelar i vaginal lavage, svamp börda och dränerande lymfkörteln ger leukocyter. Med hjälp av narkosmedel kan magsköljning prover samlas in vid flera tidpunkter på samma möss för longitudinella utvärdering avinfektion / kolonisering. Dessutom kräver denna modell ingen immunosuppressiva medel att initiera infektion, vilket gör att immunologiska studier under definierade värd förhållanden. Slutligen införde modellen och varje teknik här potentiellt kan ge upphov till användning av metoder för att undersöka andra smittsamma sjukdomar i de nedre kvinnliga könsorgan (bakterier, parasiter, virus) och respektive lokal eller systemisk försvar värd.

Protocol

1. Vaginal inokulering med Candida albicans Tre dagar före inokulering, medan besöksförbud djuret att exponera buken, injicera 100 ìl sesamolja innehåller 0,1-0,5 mg β-estradiol subkutant i nedre delen av magen. Advance nålen ca 5 till 10 mm i sidled på huden för att minimera läckaget från injektionsstället. Den subkutan administrering av östrogen i nedre delen av magen är optimal i den här modellen på grund av närheten till könsorganen. Effektiva doser kan variera musstammar…

Discussion

En experimentell musmodell av Candida vaginit har etablerats och historiskt använts för de senaste decennierna för att studera slemhinnor värd reaktion på Candida samt för testning antimykotiska 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. De protokoll som presenteras här innehåller effektiva och mindre arbetskrävande metoder, och verkar vara en av de mest optimerade modellsystem för Candida vaginit som hittills beskrivits. Dessa tekniker möjliggör snabb kvantifiering av svamp börd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Detta arbete stöddes också delvis av Louisiana Vaccine Center och södra Louisiana Smittskyddsinstitutet forskning sponsras av Louisiana Board of Regents.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Female CBA/J mice Charles River Laboratories 01C38 5-6 weeks of age
Candida albicans (3153A) National Collection of Pathogenic Fungi, UK NCPF3153  
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547 Does not need to be pre-sterilized before use
Β-estradiol 17-valerate Sigma-Aldrich E1631 0.1-0.5mg in sesame oil
Phytone peptone Becton Dickinson 211906 Supplement with 0.1% glucose
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154  
Sabouraud dextrose agar Becton Dickinson 211584  
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138 0.25%
Dispase Invitrogen 17105-041 1.7 U/ml
Wire mesh screens TWP 060X060S0065W36T No. 60 mesh, stainless
Hanks’ balanced salt solution Invitrogen 24020-117  
CytoPrep fixative Fisher Scientific 12-570-10 Preserves smear slides
Papanicolaou stain EA-65 EMD Chemicals 7054X-85  
Papanicolaou stain OG-6 EMD Chemicals 7052X-85  
Harris’ Alum hematoxylin EMD Chemicals 638A-85  
Isoflurane Baxter Healthcare NDC 10019-773-60 Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber

References

  1. Abraham, M. C. Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection. Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).
  2. Black, C. A. Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis. Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).
  3. Black, C. A. Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection. Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).
  4. Black, C. A. Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes. J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).
  5. Buchannan, D. L. Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification. Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).
  6. Clemons, K. V. Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity. Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).
  7. Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection. J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).
  8. Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses. Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).
  9. Enjalbert, B. A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. 77 (11), 4847-4847 (2009).
  10. Feinen, B. Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection. Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).
  11. Fidel, P. L. Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis. Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).
  12. Fidel, P. L. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).
  13. Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).
  14. Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).
  15. Fidel, P. L. A murine model of Candida glabrata vaginitis. J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).
  16. Fidel, P. L. Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).
  17. Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).
  18. Fidel, P. L., Sobel, J. D. Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Microbiol. Rev. 9. 9, 335-335 (1996).
  19. Fidel, P. L., Sobel, J. D., Zak, O., Sande, M. . Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy. , 741-748 (1999).
  20. Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).
  21. Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance. Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).
  22. Gill, N. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).
  23. Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice. Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).
  24. Hamad, M. Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection. Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).
  25. LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).
  26. McGrory, T., Garber, G. E. Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection. Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).
  27. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).
  28. Nomanbhoy, F. Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity. Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).
  29. Pietrella, D. A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique. Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).
  30. Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).
  31. Saavedra, M. Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).
  32. Sobel, J. D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).
  33. Sobel, J. D. Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Infect. Dis. 14, S148-S153 (1992).
  34. Sobel, J. D. Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).
  35. Song, W. Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice. Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).
  36. Taylor, B. N. In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).
  37. Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis. Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).
  38. Tirabassi, R. S. A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2. Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).
  39. Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).
  40. Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis. J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).
  41. Yano, J. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yano, J., Fidel, Jr., P. L. Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis. J. Vis. Exp. (58), e3382, doi:10.3791/3382 (2011).

View Video