Summary
Мы описываем использование perfluorodecalin как инфильтративный монтажа среды. Это простой способ улучшения глубину изображения в
Abstract
Проблема получения изображений с высоким разрешением вглубь биологических образцов широко признается 1. В заполненных воздухом ткани, такие как губчатые мезофилла листьев растений или позвоночных легкие дополнительные трудности возникают из нескольких переходов в преломления между клеточными компонентами, между клетками и воздушного пространства, а также между биологической ткани и остальной частью оптической системы. Более того, показатель несоответствия индекса приводит к затуханию флуорофора возбуждения и эмиссии сигнала в флуоресцентной микроскопии. Мы описываем здесь применение перфторуглеродов, perfluorodecalin (ПФО), как инфильтративный среду визуализации который оптически улучшает лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) образец изображения на глубине, не прибегая к повреждающим увеличения мощности лазера и оказывает минимальное физиологическое воздействие 2. Мы опишем протокол для использования в ПФО с Arabidopsis thaliana ткани листа, который является оптически сложным, как в результате егоструктуры (рис. 1). ПФО имеет ряд атрибутов, которые делают его подходящим для этих целей 3. Преломления ПФО (1,313), сопоставима с показателями воды (1,333) и ближе к цитозоле (около 1,4), чем воздух (1.000). Кроме того, ПФО легко доступна, не флуоресцентные и не токсичен. Низкое поверхностное натяжение ПФО (19 дин см -1) ниже, чем у воды (72 дин см -1), а также ниже предела (25 - 30 дин см -1) для проникновения устьичного 4, что позволяет ей наводнения губчатого мезофилла воздушного пространства без применения потенциально разрушительные вакууме или поверхностно-активных веществ. Наконец, и самое главное, ПФО имеет большой потенциал для растворения СО 2 и О 2, которая позволяет газообмен будет поддерживаться в затопленном ткани, таким образом минимизируя влияние на физиологические образца. Эти свойства были использованы в различных приложениях, которые включают частичное жидкости дыхания и легких инфляцииТион 5,6, хирургия 7, искусственной крови 8, оксигенации питательной среды 9, и исследования кристаллов льда образование в растениях 10. В настоящее время он является общим для монтирования ткани в воду или водный буфер для живых конфокальной микроскопии. Мы считаем, что использовать ПФО в качестве монтажной среда представляет собой улучшение по существующей практике и позволяет простым подготовки живых образцов цельной лист для работы с изображениями.
Protocol
Протокол ниже описан простой способ использования ПФО как инфильтративный монтажа среды в Arabidopsis thaliana листьев, но мы ожидаем, что этот метод может быть использован в различных приложениях, где изображения воздух богатых тканей желательно.
1. Монтажный лист образцов в ПФО
- Подготовка предметное стекло с газопроницаемых прокладка полидиметилсилоксана (PDMS, Каролина Наблюдение гель). PDMS является вязкоупругих полимеров и можно формовать, чтобы обеспечить камере с учетом экспериментальных требованиям.
- Равновесие ПФО с воздухом. Это может быть достигнуто путем пропускания с воздухом или при встряхивании небольшом объеме ПФО в заполненных воздухом бутылку.
- Декантировать ПФО в открытую чашку Петри и плавать весь рассады или вырезают лист на ОФП в течение 5 минут. Ткань должна стать прозрачным, напоминает керамической ткани (рис. 2 (а)). Листья могут быть темнее или светлее, чем до воздействия ПФО, зависимостьдинь от условий освещения и возраст ткани используются.
- Заполнить камеру PDMS с воздухом уравновешенную ПФО и тщательно передачи образцов тканей блюдо инкубации Петри в камеру PDMS. Печать слайда с покровным и изображения в соответствии с экспериментальным требованиям.
- Примечание: ПФО также хорошо работает в открытой камерой построенной на покровное или в перфузии камеру и совместим с силиконовой смазки. ПФО не совместим с компонентами тефлон, как она растворяет их.
2. Представитель Результаты:
Микроскопический осмотр ПФО инкубировали образцы листьев показывает, что большая часть воздушного пространства затоплены. Рисунок 2 (В) показывает, воздушного пространства залиты рекомбинантного GFP приостановлено в ПФО. Очевидно, что лист затопленных при инкубации с ПФО, но это случайные карманы воздуха может остаться. Вода не наводнение листьев в этих условиях. LSCM образцов инкубировали и монтируется в л, вода или ПФО показывает, что ПФО дает преимущество по сравнению с водой и воздухом в глубине изображения возможно (рис. 3). Пример, приведенный на рисунке 3 показано, воздуха, воды и ПФО установлены Arabidopsis листьев выражения cytosolically локализованных Венера, вариант YFP 11, что выражается конститутивно под 35S промотора. Мы видим примерный 2-кратное увеличение глубины изображения при сравнении ПФО и воды. Следует отметить, однако, что точное улучшение видели при использовании ПФО меняется с числовой апертурой объектива и тип ткани используется. Мы видели, цитоплазматические потокового и удлинение корень волоса в ПФО лечение саженцы, каждый указывает на здоровые растения. Кроме того, мы показали, что 2 Fv / Fm, мерой фотосинтеза функционирования растений 12 остается в допустимых пределах в течение сроков, используемый в области обработки изображений.
3394fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Завод сложности листа и оптического последствия
Схематично представление показывает анатомические особенности А. thaliana листа по отношению к оптической установки. Сокращения, используемые в объект. = Объектива, IMM. = Иммерсионной жидкости, СОУ. = Покровное, шоссе. = Mountant, вырезать. = Кутикулы, объявления. эп. = Адаксиальной эпидермиса, ул. = Устьичного пор, зр. = Губчатого мезофилла, а = воздушного пространства, приятель. = Частокол мезофилла, VB = сосудистого пучка, объявления. эп. = Адаксиальной эпидермиса. Клеточные стенки, обозначены черными линиями.
Рисунок 2. ПФО легко проникает Arabidopsis листьев
() Листья инкубировали в воздухе, воде или ПФО в течение 5 минут и отображаемого использованием Leica DCF3000FX цифровую камеру с микроскопом Leica MZ16F (Leica Microsystems (Великобритания) Ltd, Милтон Кейнс, Великобритания). Юпитер логотип был напечатан на ацетатной пленки и освещенные сюдам ниже с световой короб. Экспозиция составила 89 мс, а все изображения были собраны и обработаны одинаково. Шкала бары представляют 2 мм.
(Б) ПФО проведении очищенный рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) ограничивает воздушного пространства в естественных условиях. GFP является ложным окрашены в зеленый и красный используется, чтобы показать хлорофилла авто-флуоресценции, которая разграничивает клеток мезофилла. (Рис. 2 (б) воспроизводится с разрешения и полное технические детали доступны в Littlejohn и соавт. 2010 2). Шкала бары представляют 25 м.
Рисунок 3. ПФО улучшает конфокальной микроскопии в листьях
LSCM изображения, показывающие цитоплазматически локализованных Венеры флуоресценции (зеленый) и хлорофилла аутофлюоресценция (красный) в интактных thaliana А. листьев отображается в воздух, воду или ПФО. Длина волны возбуждения была 514 нм и флуоресценции излучение было зафиксировано в 518 нм 604 нм для Венеры и при 657 нм679 нм для хлоропластов. Каждая панель представляет собой один конфокальный разделе взяты из Ъ-стек 11 конфокальных изображений, полученных при 5 мкм интервалами. Они были извлечены из полного Z-стек из 59 изображений, полученных на 1 мкм интервалов, которые были использованы для подготовки дополнительных фильмов. Глубина измерений приведены по отношению к эпидермальным поверхности. Представитель изображений, которые обрабатываются одинаково, показаны. Экспериментальные данные, такие как микроскоп настройки аналогичны тем, которые содержатся в Littlejohn и соавт., 2010 2. Scalebars представляют 20 мкм.
Discussion
Это простой и легкий в использовании техники для улучшения микроскопии заполненных воздухом или оптически комплекс тканей. Мы показали, что метод имеет ряд существенных преимуществ, и мы надеемся, что он будет использоваться, чтобы выяснить биологические вопросы, связанные с воздушным богатых тканей. Например, было бы естественным выбором для исследования патогенных атаке в растительных мезофилла или в легких. Мы также осознаем ограниченность техники. Мы работаем над лучшей преломления соответствующий индекс, используйте с другими видами микроскопии и перфторуглеродов mountant пополнения в течение длительных сроков экспериментов. Мы также признаем, однако, что одним из основных преимуществ ПФУ, то есть быть биологически инертным есть обратная сторона. ПФУ не растворяются биологических молекул, которая также подразумевает, что они не могут быть легко использованы для доставки соединений, представляющих интерес, таких как гормоны, наркотики, и других малых молекул или ионов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Николая Смирнова из Университета Эксетера за совет и Университет фонда Bioimaging Эксетер. Финансирование было предоставлено Великобритании биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (грант ссылкой BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
