Summary
Nous décrivons l'utilisation de perfluorodécaline comme un moyen d'infiltration de montage. C'est une méthode simple pour améliorer la profondeur de l'imagerie dans
Abstract
Le problème de l'acquisition d'images haute résolution en profondeur dans des échantillons biologiques est largement reconnue 1. Dans l'air rempli de tissus tels que le mésophylle spongieux des feuilles des plantes ou des poumons de vertébrés autres difficultés proviennent de plusieurs transitions de l'indice de réfraction entre les composants cellulaires, entre les cellules et espaces aériens et entre les tissus biologiques et le reste du système optique. Par ailleurs, les inadéquations indice de réfraction conduire à une atténuation de l'excitation et d'émission du signal fluorophore en microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici l'application du perfluorocarbone, perfluorodécaline (VFI), comme un moyen d'imagerie infiltrante qui améliore optiquement microscopie confocale à balayage laser (LSCM) de l'échantillon d'imagerie en profondeur, sans recourir à des augmentations d'endommager la puissance du laser et a un impact minimal sur physiologiques 2. Nous décrivons le protocole d'utilisation des VFI avec le tissu des feuilles d'Arabidopsis thaliana, ce qui est optiquement complexes en raison de sesstructure (figure 1). PFD a un certain nombre d'attributs qui le rendent approprié pour cet usage 3. L'indice de réfraction du VFI (1,313) est comparable à celle de l'eau (1,333) et est proche de celui de cytosol (environ 1,4) que l'air (1.000). En outre, les VFI sont facilement accessibles, non fluorescentes et est non toxique. La faible tension de surface du VFI (19 dynes cm -1) est plus faible que celle de l'eau (72 dynes cm -1) et également inférieur à la limite (25 - 30 cm Dyne -1) pour la pénétration stomatique 4, ce qui lui permet d'inonder les espaces aériens mésophylle spongieux sans l'application d'un vide potentiellement destructeurs ou d'un tensioactif. Enfin et surtout, VFI a une grande capacité à dissoudre le CO 2 et O 2, qui permet l'échange de gaz pour être maintenu dans le tissu inondées, minimisant ainsi l'impact physiologique sur l'échantillon. Ces propriétés ont été utilisées dans différentes applications qui incluent la respiration partielle liquides et pulmonaires inflationtion 5,6, la chirurgie 7, 8 du sang artificiel, l'oxygénation de la croissance des médias 9, et les études de la formation de cristaux de glace dans les plantes 10. Actuellement, il est courant de monter des tissus dans l'eau ou tampon aqueux pour l'imagerie confocale en direct. Nous considérons que l'utilisation des VFI comme un milieu de montage représente une amélioration sur la pratique existante et permet la préparation simple de vivre ensemble des échantillons de feuilles pour l'imagerie.
Protocol
Le protocole donné ci-dessous décrit une méthode simple pour l'utilisation de VFI comme un moyen de montage d'infiltration dans des feuilles d'Arabidopsis thaliana, mais nous prévoyons que cette méthode peut être utilisée dans une variété d'applications où l'imagerie aérienne tissus riches est souhaitée.
1. Échantillons de feuilles de montage dans un VFI
- Préparer une lame de microscope avec un joint perméable aux gaz de polydiméthylsiloxane (PDMS, Caroline observation Gel). PDMS est un polymère viscoélastique et peut être moulé pour fournir une chambre adaptée aux besoins expérimentaux.
- Equilibrer VFI avec l'air. Ceci peut être réalisé par barbotage à l'air ou en le secouant un petit volume de VFI dans une bouteille remplie d'air.
- Décanter PFD dans un plat de Petri ouverte et flottent un semis tout ou feuilles excisées sur le VFI pendant 5 minutes. Le tissu doit devenir translucide, rappelant des tissus vitrifiés (figure 2 (a)). Les feuilles peuvent apparaître plus foncées ou plus légers que avant l'exposition au VFI, dépendanceDing sur les conditions d'éclairage et de l'âge du tissu utilisé.
- Remplir la chambre de PDMS avec air-équilibrée PFD et transférer soigneusement les échantillons de tissus de l'antenne d'incubation de Petri à la chambre de PDMS. Sceau de la diapositive avec une lamelle et l'image en fonction des besoins expérimentaux.
- Remarque: PFD effectue aussi bien dans une chambre ouverte construite sur une lamelle ou dans une chambre de perfusion et est compatible avec de la graisse silicone. VFI n'est pas compatible avec les composants en téflon comme il les dissout.
2. Les résultats représentatifs:
L'inspection microscopique des échantillons de feuilles VFI-incubées montre que la majorité des espaces aériens sont inondées. La figure 2 (b) montre espaces inondés recombinante GFP en suspension dans un VFI. Il est évident que la feuille est inondé par incubation avec un VFI, mais que des poches occasionnelles d'air peuvent subsister. L'eau n'inonde pas les feuilles dans ces conditions. LSCM des échantillons incubés et monté dans un ir, l'eau ou VFI VFI montre donne un avantage sur l'eau et l'air dans la profondeur de l'imagerie possible (figure 3). L'exemple donné dans la figure 3 montre Arabidopsis air, l'eau et des VFI montés laisse exprimer cytosolically localisée Vénus, une variante de la YFP 11 qui est exprimé de façon constitutive sous le promoteur 35S. Nous pouvons voir une multiplication par 2 environ augmentation de la profondeur de l'imagerie en comparant VFI et de l'eau. Il faut noter, cependant, que l'amélioration précise vu lors de l'utilisation VFI varie avec l'ouverture numérique de la lentille et le type de tissu utilisé. Nous avons vu le streaming cytoplasmique et l'allongement des poils racinaires de plants traités VFI, chaque indicatif de plantes saines. En outre, nous avons montré que les deux Fv / Fm, une mesure du fonctionnement photosynthétique des plantes 12 reste dans des limites tolérables sur des périodes utilisées dans l'imagerie.
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Figure 1. La complexité des feuilles des végétaux et des implications optiques
Représentation schématique montrant les caractéristiques anatomiques de l'A. feuilles thaliana par rapport à l'optique de mettre en place. Les abréviations utilisées sont obj. = Lentille d'objectif, imm. Liquide d'immersion =, couv. = Lamelle, mnt. = Milieu de montage, couper. = Cuticule, ad. ep. = Épiderme adaxiale, st. = Pores stomatiques, sp. = Mésophylle spongieux, comme = espace aérien, mon pote. = Mésophylle palissade, vb = faisceau vasculaire, ad. ep. L'épiderme = adaxiale. Les parois cellulaires sont indiquées par des lignes noires.
Figure 2. VFI pénètre facilement des feuilles d'Arabidopsis
(A) Feuilles incubés dans l'air, l'eau ou un VFI pendant 5 minutes et imagée en utilisant un Leica DCF3000FX appareil photo numérique avec un microscope Leica MZ16F (Leica Microsystems (RU) Ltd, Milton-Keynes, Royaume-Uni). Le logo a été imprimé sur JoVE film d'acétate et illuminé BOFm au-dessous d'une boîte à lumière. Le temps d'exposition était de 89 ms et toutes les images ont été collectées et traitées de manière identique. Barres d'échelle représentent de 2 mm.
(B) VFI portant recombinant purifié la protéine fluorescente verte (GFP) délimite espaces aériens in vivo. GFP est faux de couleur verte et rouge est utilisé pour montrer l'auto-fluorescence chlorophyllienne, qui délimite les cellules du mésophylle. (Figure 2 (b) reproduit avec la permission et plein de détails techniques disponibles dans Littlejohn et al. 2010 2). Barres d'échelle représentent 25 m.
Figure 3. VFI améliore l'imagerie confocale dans les feuilles
Images montrant LSCM cytoplasme localisée Venus de fluorescence (vert) et autofluorescence chlorophylle (rouge) chez A. thaliana intacte feuilles imagé dans l'air, l'eau ou de VFI. Longueur d'onde d'excitation était de 514 nm et d'émission de fluorescence a été enregistré à 518 nm 604 nm pour Vénus et 657 nm au679 nm pour les chloroplastes. Chaque panneau est une seule section confocale prises à partir d'un Z-stack de 11 images acquises confocale à intervalles de 5 um. Ils ont été extraites d'une pleine Z-stack de 59 images acquises à intervalles de 1 um, qui ont été utilisés pour produire des films supplémentaires. Les mesures de profondeur sont donnés par rapport à la surface de l'épiderme. Images représentant, qui ont été traitées de façon identique, sont affichées. Les détails expérimentaux tels que les paramètres de microscope sont identiques à ceux trouvés dans Littlejohn et al. 2010 2. Barres d'échelle représentent 20 um.
Discussion
C'est une technique simple et facile à utiliser pour améliorer la microscopie remplis d'air ou optiquement complexes tissus. Nous avons montré que la technique a des avantages solides et nous espérons qu'il sera utilisé pour élucider des questions biologiques se rapportant à l'air riche en tissus. Par exemple, il serait un choix naturel pour les études de l'attaque de pathogènes dans mésophylle des plantes ou dans les poumons. Nous sommes également conscients des limites de la technique. Nous travaillons sur une meilleure adéquation entre l'indice de réfraction, l'utilisation des autres modes de microscopie et de réapprovisionnement perfluorocarbone milieu de montage pendant de longues expériences calendrier. Nous reconnaissons aussi, cependant, que l'un des principaux avantages de PFC, à savoir être biologiquement inertes a une Flipside. PFC ne se dissolvent pas facilement des molécules biologiques qui implique également qu'ils ne peuvent pas être facilement utilisé pour délivrer des composés d'intérêt tels que les hormones, les médicaments et autres petites molécules ou d'ions.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le professeur Nicholas Smirnoff de l'Université d'Exeter, pour ses conseils et de l'Université de l'installation de bio-imagerie Exeter. Le financement a été fourni par la biotechnologie et sciences biologiques au Royaume-Uni Conseil de recherches (subvention de référence BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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