Summary
Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.
Abstract
Biyolojik örnekler derinliklerine yüksek çözünürlüklü görüntüler elde sorun yaygın olarak 1 kabul edilir . Süngerimsi mezofil hücreleri ve hava sahasındaki arasında ve biyolojik doku ve optik sistemin geri kalanı arasındaki hücresel bileşenleri arasındaki kırılma indisi çoklu geçişler, daha fazla zorluklar ortaya çıkan bitki yaprakları veya omurgalı akciğerler gibi hava dolu doku. Ayrıca, refraktif indeks uyumsuzlukları fluorofor uyarma ve floresan mikroskobu sinyal emisyon zayıflama neden olur. Biz perflorokarbon uygulama perfluorodecalin (PFD), optik, lazer güç zarar artar başvurmadan, derinlik konfokal mikroskobu (LSCM) örnek görüntüleme lazer tarama artırır ve fizyolojik etkilerini minimum 2 infiltratif bir görüntüleme aracı olarak burada açıklayın . Biz onun bir sonucu olarak optik karmaşık Arabidopsis thaliana yaprak dokusu ile PFD kullanımı için protokol tarifyapısı (Şekil 1). PFD 3 bu kullanım için uygun hale öznitelikleri bir numarası vardır. PFD kırılma indisi (1.313), su (1.333) ile karşılaştırılabilir ve sitoplazmada (yaklaşık 1.4) hava (1.000) daha yakındır. Buna ek olarak, PFD floresan olmayan, hazır ve toksik değildir. Sel sağlar stoma penetrasyon 4 - PFD düşük yüzey gerilimi (19 dynes cm-1), su (72 dynes cm-1) daha düşük ve aynı zamanda sınırı (30 dyne cm -1 25) altında potansiyel olarak yıkıcı bir vakum veya surfaktan uygulama olmadan süngerimsi mezofil hava sahasındaki. Son olarak ve en önemlisi, PFD, CO 2 ve O 2, böylece gaz değişimi örnek üzerinde fizyolojik etkileri en aza indirerek, sular altında doku muhafaza sağlar çözme için büyük bir kapasiteye sahiptir . Bu özellikler, kısmi sıvı solunum ve akciğer enflasyona içeren çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadırTION 5,6 cerrahi, 7, 8 yapay kan, büyüme oksijenasyon medya 9, ve bitkiler buz 10 kristal oluşumu çalışmaları. Şu anda, canlı konfokal görüntüleme için su ya da sulu tampon doku monte etmek yaygındır. PFD montaj aracı olarak kullanımı, mevcut uygulamada bir iyileşmeyi temsil etmektedir ve görüntüleme için canlı bütün yaprak örnekleri basit bir hazırlık sağlar düşünün.
Protocol
Aşağıda verilen protokol Arabidopsis thaliana yaprakları bir infiltratif montaj aracı olarak PFD kullanarak için basit bir yöntem açıklanır, ama biz, bu yöntem görüntüleme hava zengin dokular istenilen uygulamaların çeşitli kullanılıyor olabilir tahmin ediyoruz .
1. PFD montaj yaprak örnekleri
- Polidimetilsiloksan gaz-geçirgen bir conta (PDMS Carolina Gözlem Jel) ile bir mikroskop lamı hazırlayın. PDMS viskoelastik bir polimer ve deneysel gereksinimlerine uygun bir oda sağlamak için kalıp olabilir.
- Hava ile PFD dengeye. Bu hava ile köpüren veya hava dolu bir şişede PFD küçük hacimli bir sallayarak elde edilebilir.
- Durusu açık bir Petri kabı içine PFD ve bütün bir fide veya 5 dakika PFD eksize yaprak yüzer. Doku (Şekil 2 (a)), yarı saydam, vitrifiye doku anımsatan haline gelmelidir . Yapraklar PFD, bağımlı maruz kalmadan önce daha koyu veya daha açık bir şekilde görünebilir.aydınlatma koşulları ve doku yaşına göre kullanılır.
- PDMS odasına hava dengelenmiş PFD ile doldurun ve dikkatle PDMS odasına kuluçka Petri kabı doku örnekleri aktarmak. Deneysel gereksinimlerine göre lamel ve görüntü ile slayt Seal.
- Not: PFD de bir lamel üzerine inşa açık bir oda veya bir perfüzyon odasında iyi bir performans sergilediğini ve silikon gres ile uyumlu. Erirken PFD teflon bileşenleri ile uyumlu değildir.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
PFD-inkübe yaprak örneklerinin mikroskobik muayene, hava sahasındaki çoğunluğu Şekil 2 (b) PFD askıya rekombinant GFP ile sular altında hava sahasındaki gösterir sular altında olduğunu gösterir . Yaprak PFD ile inkübasyon üzerine sular altında olduğu açıktır, ama hava o zaman zaman ceplerinde kalır. Su, bu koşullar altında bir yaprak sel değildir. Numune LSCM inkübe ve monte ir, su ya da, PFD (Şekil 3) görüntüleme derinliğinde su ve hava üzerinde bir avantaj verdiğini PFD gösterir . Şekil 3'te verilen örnekte, hava, su ve PFD monte Arabidopsis cytosolically lokalize Venüs, YFP 11 35S promotör altında yapısal olarak ifade edilir bir varyantı ifade yaprakları gösterir . PFD ve su karşılaştırırken görüntüleme derinliği yaklaşık 2 kat artış görebilirsiniz. PFD kullanarak görülen kesin iyileşme sayısal diyafram ile lens ve kullanılan doku tipi değişir, ancak dikkat edilmelidir. PFD tedavi fide sitoplazmik akışı ve kök saç uzama, sağlıklı bitkiler, her gösterge gördük. Buna ek olarak Fv / Fm, 12, bitkilerin fotosentez işleyen bir ölçüsüdür görüntülemede kullanılan zaman çizelgesi üzerinde tolere edilebilir sınırlar içinde kalmasını 2 göstermiştir.
3394fig1.jpg "/>
Şekil 1. Bitki yaprak karmaşıklığı ve optik etkileri
A. anatomik özellikleri gösteren Şematik gösterim thaliana yaprak optik set-up ile ilgili. Kullanılan kısaltmalar obj. = Objektif lens, imm. = Daldırma sıvısı, cov. = Lamel, mnt. = Mountant, kesme. = Manikür, reklam. ep. = Adaxial epidermis, st. = Stoma gözenek, sp. = Süngerimsi mezofil = hava sahasını, dostum. = Palisad mezofil, fi = vasküler paket, reklam. ep. = Adaxial epidermis. Hücre duvarları siyah çizgilerle gösterilir.
Şekil 2. PFD kolayca Arabidopsis yaprakları nüfuz
(A) hava, su inkübe veya 5 dakika için PFD ve Leica MZ16F mikroskop (Leica Microsystems (UK) Ltd, Milton Keynes, Birleşik Krallık) ile Leica DCF3000FX dijital kamerayı kullanarak görüntülü bırakır. Vallahi logosu asetat film baskılı ve fro aydınlatmalım aşağıda bir ışık kutusu. Pozlama süresi 89 ms ve tüm görüntüleri toplanan ve aynı şekilde işlendi. Ölçek çubuklar 2 mm temsil eder.
(B) PFD in vivo olarak rekombinant yeşil floresan proteininin (GFP) saflaştırılmış hava sahasındaki sınırlandırır taşıma. GFP yanlış renkli yeşil ve kırmızı klorofil mezofil hücreleri sınırlandırıyor oto-floresan, göstermek için kullanılır. (Şekil 2 (b) izni ve tüm teknik detayları Littlejohn ark ile çoğaltılamaz 2010 2). Ölçek bar, 25 m. temsil
Şekil 3. PFD yaprakları konfokal görüntüleme artırır
LSCM sağlam A. thaliana cytoplasmically lokalize Venüs floresans (yeşil) ve klorofil otofloresans (kırmızı) gösteren görüntüler, hava, su ya da PFD görüntülü bırakır. Dalgaboyu 514 nm ve floresans emisyon Venüs için 604 nm ile 518 nm kaydedildi ve 657 nmKloroplast için 679 nm. Her panel, 5 mikron aralıklarla alınan 11 konfokal görüntüleri Z-yığından alınan tek bir konfokal bölümünde. Bu ek filmleri üretmek için kullanılan 1 mikron aralıklarla elde edilen 59 görüntü tam bir Z-yığını çıkarıldı. Derinlik ölçümleri epidermal yüzeye göre verilmiştir. Aynı şekilde işlendi Temsilcisi görüntüler, gösterilmiştir. Deneysel mikroskop ayarları gibi ayrıntılar, Littlejohn ve ark. 2010 2 bulunanlara aynıdır . Scalebars 20 mikron temsil eder.
Discussion
Bu hava ile doldurulmuş veya optik karmaşık dokuların mikroskopi artırmak için basit ve kullanımı kolay bir tekniktir. Biz tekniği, bazı güçlü avantajlara sahiptir ve biz bu hava zengin dokulara ait biyolojik soruları aydınlatmak için kullanılan olacağını umuyoruz göstermiştir. Örneğin, bitki mezofil ya da akciğerlerde patojen saldırı çalışmaları için doğal bir seçim olacaktır. Ayrıca tekniğin sınırlılıkları farkında. Biz daha iyi refraktif indeksi eşleşen üzerinde çalışıyoruz, uzun zaman ölçeğinde deneyler sırasında mikroskopi diğer modları ve perflorokarbon mountant ikmal kullanın. Ayrıca PFC en önemli avantajlarından biri, yani biyolojik olarak tesirsiz bir flipside olsa da, tanımak. PFC, ayrıca hormonlar, ilaçlar, ve diğer küçük moleküller veya iyonlar gibi ilgi bileşikleri kolayca sunmak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir biyolojik moleküllerin kolayca çözülür.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, onun tavsiye ve Exeter Üniversitesi bio-Tesis Exeter Üniversitesi'nden Prof. Nicholas Smirnoff teşekkür etmek istiyorum. Finansman İngiltere Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (hibe referans BB/E002682/1) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
