Summary
Vi beskriver brugen af perfluorodecalin som en infiltrativ montering medium. Dette er en enkel metode til at forbedre dybde af billeddiagnostik
Abstract
Problemet med at erhverve høj opløsning billeder dybt ind i biologiske prøver, er almindeligt anerkendt 1. I luftfyldt væv såsom svampede mesophyll af plante-blade eller hvirveldyr lunger yderligere vanskeligheder, der opstår fra flere overgange i brydningsindeks mellem cellulære komponenter, mellem celler og luftrum og mellem biologisk væv og resten af det optiske system. Desuden brydningsindeks misforhold føre til svækkelse af fluoroforen excitation og signal emission i fluorescens mikroskopi. Vi beskriver her anvendelsen af perfluorcarbon, perfluorodecalin (PFD), som en infiltrativ imaging medium, der er optisk forbedrer laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM) prøve billeddannelse i dybden, uden at ty til skadelige stigninger i laser magt og har en minimal fysiologisk virkning 2. Vi beskriver en protokol for brugen af PFD med Arabidopsis thaliana blade væv, som er optisk kompleks som følge afstruktur (Figur 1). PFD har en række egenskaber, der gør det egnet til dette brug 3. Brydningsindekset af PFD (1,313) er sammenlignelig med vand (1,333) og er tættere på, at i cytosolen (ca. 1,4) end luft (1.000). Desuden er PFD let tilgængelige, ikke-fluorescerende og er ikke giftig. Den lave overfladespænding PFD (19 dynes cm -1) er lavere end vands (72 dynes cm -1), og også under den grænse (25 til 30 dyn cm -1) for stomatal penetration 4, der gør det muligt at oversvømme den svampede mesophyll luftrum og uden anvendelse af en potentielt ødelæggende vakuum eller overfladeaktivt stof. Endelig og afgørende, PFD har en stor evne til at opløse CO 2 og O 2, som giver gasudveksling der skal opretholdes i de oversvømmede væv og derved minimere den fysiologiske effekt på prøven. Disse egenskaber har været brugt i forskellige applikationer, der omfatter delvis flydende vejrtrækning og lunger inflationtion 5,6, kirurgi 7, kunstigt blod 8, iltningen af vækstmedier 9, og studier af iskrystal dannelse i planter 10. I øjeblikket er det almindeligt at montere væv i vand eller vandige buffer til live konfokal billedbehandling. Vi mener, at brugen af PFD som Mounting Medium er en forbedring på eksisterende praksis og giver den enkle tilberedning af levende hele blade prøver til billeddannelse.
Protocol
Protokollen nedenfor beskriver en simpel metode til at bruge PFD som et infiltrativ montering medium i Arabidopsis thaliana blade, men vi forventer, at denne metode kan anvendes i en lang række applikationer, hvor billeddannelse luft-rige væv ønskes.
1. Montering blad prøver i PFD
- Forbered et objektglas med en gas-gennemtrængelige pakning af polydimethylsiloxan (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS er et viskoelastisk polymer og kan formes til at give et kammer er skræddersyet til eksperimentelle krav.
- Ligevægt PFD med luft. Dette kan opnås ved at boble med luft eller ved at ryste en lille mængde PFD i en luft-fyldt flaske.
- Omhældes PFD i et åbent petriskål og flyde en hel frøplante eller fjernede blade på PFD i 5 minutter. Vævet skal være gennemsigtige, der minder om forglasset væv (Figur 2 (a)). Blade kan virke mørkere eller lysere end før udsættelse for PFD, afhængigeDing på lysforhold og alder af væv anvendes.
- Fyld PDMS kammeret med air-ekvilibreres PFD og omhyggeligt overføre vævsprøver fra inkubation petriskaalen til PDMS kammeret. Forsegle slide med et dækglas og billede i overensstemmelse med eksperimentelle krav.
- Bemærk: PFD også klarer sig godt i et åbent kammer bygget på et dækglas eller i en perfusion kammer og er kompatibel med silicium fedt. PFD er ikke kompatibel med Teflon komponenter som det opløser dem.
2. Repræsentative resultater:
Mikroskopisk undersøgelse af PFD-rugede blad prøver viser, at størstedelen af luftrum er oversvømmet. Figur 2 (b) viser luftrum oversvømmet med rekombinant GFP suspenderet i PFD. Det er tydeligt, at bladet er oversvømmet ved inkubation med PFD, men at der lejlighedsvis luftlommer kan forblive. Vandet ikke oversvømmer bladet under disse betingelser. LSCM af prøver inkuberes og monteret i en ir, vand eller PFD viser, at PFD giver en fordel i forhold til vand og luft i dybden af billeddata muligt (Figur 3). Eksemplet i Figur 3 viser luft, vand og PFD monteret Arabidopsis blade udtrykke cytosolically lokaliseret Venus, en variant af YFP 11, der kommer til udtryk konstitutivt under 35S promotor. Vi kan se en omtrentlig 2-fold stigning i dybden af billeddannelse, når man sammenligner PFD og vand. Det skal dog bemærkes, at den præcise forbedring ses, når du bruger PFD varierer med numeriske åbning af linsen og den type væv, der anvendes. Vi har set cytoplasmatisk streaming og rod hår forlængelse i PFD behandlede planter, hvert tegn på sunde planter. Derudover har vi vist 2, at Fv / Fm, et mål for fotosyntetiske funktion af planter 12 forbliver inden for acceptable grænser over tidsperioder, der anvendes i billedbehandling.
3394fig1.jpg "/>
Figur 1. Plant blad kompleksitet og optisk konsekvenser
Diagrammatical repræsentation viser anatomiske træk af A. thaliana blad i forhold til den optiske set-up. Anvendte forkortelser er obj. = Objektiv, IMM. = Fordybelse væske, cov. = Dækglas, mnt. = Indlejringsolie, snit. = Neglebånd, annonce. ep. = Adaxial epidermis, st. = Stomatal pore, sp. = Svampet mesophyll, som = luftrum, kammerat. = Palisade mesophyll, vb = vaskulær bundt, ad. ep. = Adaxial epidermis. Cellevægge er angivet med sorte linjer.
Figur 2. PFD let trænger Arabidopsis blade
(A) Blade inkuberet i luft, vand eller PFD i 5 minutter og filmede med et Leica DCF3000FX digitalt kamera med et Leica MZ16F mikroskop (Leica Microsystems (Storbritannien) Ltd, Milton-Keynes, England). Den JOVE Logoet blev trykt på acetat film og oplyste tilbagem ned med en lyskasse. Eksponeringstid var 89 ms, og alle billeder blev indsamlet og behandlet ens. Skala søjler repræsenterer 2 mm.
(B) PFD transporterer renset rekombinant grønt fluorescerende protein (GFP) afgrænser luftrum in vivo. GFP er falsk farvet grøn og rød bruges til at vise klorofyl auto-fluorescens, som afgrænser mesophyll celler. (Figur 2 (b), gengivet med tilladelse og fuld tekniske detaljer findes i Littlejohn et al. 2010 2). Skala søjler repræsenterer 25 m.
Figur 3. PFD forbedrer konfokal scanning i blade
LSCM billeder, der viser cytoplasmically lokaliseret Venus fluorescens (grøn) og klorofyl autofluorescens (rød) i intakt A. thaliana blade afbildet i luft, vand eller PFD. Excitation bølgelængde er 514 nm og fluorescens emission er optaget ved 518 nm 604 nm for Venus og at 657 nm679 nm for kloroplaster. Hvert panel er en enkelt konfokal afsnit taget fra en Z-stack på 11 konfokal billeder erhverves til 5 m intervaller. Disse blev udvundet fra en fuld Z-stak af 59 billeder erhvervet ved 1 μm mellemrum, som er blevet brugt til at producere yderligere film. Dybde målinger er givet i forhold til den epidermale overflade. Repræsentant billeder, der blev behandlet ens, er vist. Eksperimentel detaljer såsom mikroskop indstillinger er identiske med dem der findes i Littlejohn et al., 2010 2. Scalebars repræsenterer 20 μm.
Discussion
Dette er en enkel og let at bruge teknik til at forbedre mikroskopi af luftfyldte eller optisk komplekse væv. Vi har vist, at teknikken har nogle stærke fordele, og vi håber, at det vil blive brugt til at belyse biologiske spørgsmål vedrørende luft-rige væv. For eksempel ville det være et naturligt valg for studier af patogen angreb i anlægget mesophyll eller i lungerne. Vi har også er opmærksomme på begrænsningerne af teknikken. Vi arbejder på bedre brydningsindeks matching, brug med andre former for mikroskopi, og perfluorcarbon indlejringsolie opfyldning under lange tidsskala eksperimenter. Vi anerkender også, selv om, at en af de største fordele af PFC, nemlig at være biologisk inaktivt har en Flipside. PFC ikke let opløses biologiske molekyler, som også indebærer, at de ikke let kan benyttes til at levere forbindelser af interesse såsom hormoner, narkotika og andre små molekyler eller ioner.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke professor Nicholas Smirnoff fra University of Exeter for hans råd og University of Exeter Bioimaging Facility. Finansieringen blev givet af den britiske Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (fastlæggelse af referencebeløb BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
