Summary
Se describe el uso de perfluorodecalina como un medio de infiltración de montaje. Este es un método sencillo para mejorar la profundidad de la imagen en
Abstract
El problema de la adquisición de imágenes de alta resolución de profundidad en las muestras biológicas es ampliamente reconocido 1. En el aire lleno de tejidos, tales como el mesófilo esponjoso de las hojas de la planta o en los pulmones de vertebrados más dificultades surgen de múltiples transiciones en el índice de refracción entre los componentes celulares, entre las células y su espacio aéreo y entre el tejido biológico y el resto del sistema óptico. Por otra parte, los desajustes del índice de refracción conducir a una atenuación de la excitación y la emisión de la señal de fluoróforo en microscopía de fluorescencia. Se describe aquí la aplicación de los perfluorocarbono, perfluorodecalina (PFD), como un medio de imágenes infiltrativas que ópticamente mejora la microscopía confocal de barrido láser (LSCM) muestra imágenes en profundidad, sin necesidad de recurrir a un aumento perjudicial en potencia del láser y tiene un impacto mínimo fisiológico 2. Se describe el protocolo para el uso de PFD con el tejido Arabidopsis thaliana de la hoja, que es ópticamente complejas como resultado de suestructura (figura 1). PFD tiene una serie de atributos que lo hacen adecuado para este uso 3. El índice de refracción de PFD (1.313) es comparable con la del agua (1,333) y se acerca más a la de citosol (aprox. 1,4) que el aire (1.000). Además, el PFD es fácilmente disponible, no fluorescente y no es tóxico. La baja tensión superficial de PFD (19 dinas cm -1) es menor que la del agua (72 dinas cm -1) y también por debajo del límite (25 - 30 cm dina -1) para la penetración de los estomas 4, que permite a las inundaciones los espacios aéreos del mesófilo esponjoso sin la aplicación de un vacío potencialmente destructivos o el agente tensioactivo. Finalmente y lo más importante, PFD tiene una gran capacidad de disolución de CO 2 y O 2, que permite el intercambio de gases se mantengan en el tejido inundadas, minimizando así el impacto fisiológico en la muestra. Estas propiedades han sido utilizadas en diversas aplicaciones que incluyen la respiración líquida parcial y la inflación de pulmónción 5,6, la cirugía 7, 8 sangre artificial, la oxigenación de crecimiento de los medios 9, y los estudios de la formación de cristales de hielo en las plantas 10. En la actualidad, es común para montar los tejidos en el agua o tampón acuoso de imagen confocal en vivo. Consideramos que el uso de PFD como un medio de montaje representa una mejora en la práctica existente y permite la simple preparación de las muestras en vivo de hoja entera de imágenes.
Protocol
El protocolo se indican a continuación se describe un método sencillo de usar PFD como un medio de infiltración de montaje en las hojas de Arabidopsis thaliana, pero anticipamos que este método puede ser utilizado en una variedad de aplicaciones en las imágenes de aire rico en tejidos que se desea.
1. Montaje de muestras de hojas en PFD
- Preparar un portaobjetos con una junta de gas permeable de polidimetilsiloxano (PDMS, Carolina Gel de observación). PDMS es un polímero viscoelástico y puede ser moldeado para proporcionar una cámara adaptada a las necesidades experimentales.
- Equilibre PFD con el aire. Esto puede lograrse mediante burbujeo de aire o agitando un pequeño volumen de PFD en una botella llena de aire.
- PFD decantar en una placa de Petri abiertas y flotar una planta entera o de hojas eliminado en PFD durante 5 minutos. El tejido debe ser transparente, que recuerda a los tejidos vitrificados (Figura 2 (a)). Las hojas pueden aparecer más oscura o más clara que antes de la exposición a PFD, dependenciadiendo de las condiciones de iluminación y la edad del tejido utilizado.
- Llenar la cámara de PDMS con aire equilibrada PFD y transferir cuidadosamente las muestras de tejido de la placa de Petri de incubación de la cámara de PDMS. Sello de la diapositiva con un cubreobjetos y la imagen de acuerdo a los requerimientos experimentales.
- Nota: PFD también funciona bien en una cámara abierta construido sobre un portaobjetos o en una cámara de perfusión y es compatible con grasa de silicona. PFD no es compatible con los componentes de teflón, ya que las disuelve.
2. Los resultados representativos:
Examen microscópico de las muestras de hojas PFD-incubadas muestra que la mayoría de los espacios aéreos están inundadas. Figura 2 (b) muestra los espacios aéreos inundado recombinante GFP suspendido en PFD. Es evidente que la hoja está inundado tras la incubación con PFD, pero que las bolsas de aire ocasional puede permanecer. El agua no se inunde la hoja en esas condiciones. LSCM de las muestras se incuban y se monta en un ir, el agua o muestra PFD PFD que da una ventaja sobre el agua y el aire en la profundidad de imagen posible (Figura 3). El ejemplo de la Figura 3 se muestra Arabidopsis aire, agua y PFD montado deja expresar cytosolically localizada Venus, una variante de YFP 11, que se expresa constitutivamente en el promotor 35S. Podemos ver un aproximado de 2 veces más en profundidad de la imagen cuando se compara PFD y el agua. Cabe señalar, sin embargo, que la mejora precisa ve cuando se utiliza varía según el PFD apertura numérica de la lente y el tipo de tejido utilizado. Hemos visto corriente citoplasmática y el alargamiento de la raíz del cabello PFD plántulas tratadas, todos ellos indicativos de las plantas sanas. Además hemos demostrado que dos Fv / Fm, una medida del funcionamiento fotosintético de las plantas 12 permanece dentro de límites tolerables en escalas de tiempo utilizadas en las imágenes.
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Figura 1. Planta de la complejidad y las implicaciones de la hoja óptica
Representación esquemática que muestra las características anatómicas de la A. thaliana hojas en relación con la óptica puesta en marcha. Abreviaturas utilizadas son obj. = Lente objetivo, imm. = Líquido de inmersión, cov. = Cubreobjetos, mnt. = Medio de montaje, corte. = Cutícula, ad. ep. = Epidermis adaxial, st. = Poro estomático, sp. = Mesófilo esponjoso, como = el espacio aéreo, amigo. = Empalizada mesófilo, vb = paquete vascular, ad. ep. = Adaxial epidermis. Las paredes celulares están indicados por las líneas de color negro.
Figura 2. PFD penetra fácilmente hojas de Arabidopsis
(A) Las hojas se incubaron en el aire, el agua o PFD por 5 minutos y la imagen utilizando una Leica DCF3000FX cámara digital con un microscopio Leica MZ16F (Leica Microsystems (Reino Unido) Ltd., Milton Keynes, Reino Unido). El logotipo JoVe fue impreso en la película de acetato e iluminado lado a otrom por debajo con una caja de luz. Tiempo de exposición fue de 89 ms y todas las imágenes fueron recogidos y tratados de forma idéntica. Las barras de escala representan el 2 mm.
(B) llevar a PFD recombinante purificada la proteína verde fluorescente (GFP) delimita los espacios aéreos en vivo. GFP es de color verde falsa, y el rojo se utiliza para mostrar auto-fluorescencia de clorofila, que delimita las células del mesófilo. (Figura 2 (b) que se reproducen con el permiso y todos los detalles técnicos disponibles en Littlejohn et al. 2010 2). Las barras de escala representan 25 m.
Figura 3. PFD mejora de imagen confocal en las hojas
LSCM imágenes que muestran citoplasma localizada Venus fluorescencia (verde) y la autofluorescencia de clorofila (rojo) en A. thaliana hojas intactas imágenes en el aire, el agua o PFD. Longitud de onda de excitación fue 514 nm y emisión de fluorescencia se registró a 518 nm 604 nm de Venus y en 657 nm679 nm de los cloroplastos. Cada panel es una sola sección confocal tomado de un Z-stack de 11 imágenes confocal adquiridos en intervalos de 5 micras. Estos fueron extraídos de un total Z-stack de 59 imágenes tomadas a intervalos de 1 m, que se han utilizado para producir películas complementarias. Las mediciones de profundidad se dan en relación a la superficie epidérmica. Imágenes representativas, que se procesaron de manera idéntica, se muestran. Los detalles experimentales, tales como ajustes del microscopio son idénticos a los encontrados en Littlejohn et al., 2010 2. Scalebars representan el 20 micras.
Discussion
Esta es una técnica sencilla y fácil de usar para mejorar la microscopía llenas de aire o complejos ópticamente tejidos. Hemos demostrado que la técnica tiene algunas ventajas importantes, y esperamos que se va a utilizar para dilucidar cuestiones biológicas relacionadas con el aire rico en los tejidos. Por ejemplo, sería una elección natural para los estudios de ataque de patógenos en el mesófilo de la planta o en los pulmones. También son conscientes de las limitaciones de la técnica. Estamos trabajando en una mejor adecuación del índice de refracción, el uso de otros modos de microscopia, y la reposición de perfluorocarbono medio de montaje durante la larga escala temporal experimentos. También reconocemos, sin embargo, que una de las principales ventajas de la PFC, es decir, ser biológicamente inerte tiene un reverso. PFC no se disuelven fácilmente las moléculas biológicas que también implica que no pueden ser fácilmente utilizados para entregar los compuestos de interés como las hormonas, las drogas, y otras moléculas pequeñas o iones.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Prof. Nicolás Smirnoff, de la Universidad de Exeter por su consejo y la Universidad de Exeter Bioimagen Fondo. El financiamiento fue proporcionado por la Biotecnología del Reino Unido y Ciencias Biológicas de Investigación (subvención de referencia BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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