Summary
我们形容一个浸润安装介质使用的全氟萘烷。这是一个简单的方法，为提高成像深度
Abstract
到生物样品中获取高分辨率图像深的问题是普遍承认 1。在充满空气，如海绵状植物叶片或脊椎动物肺部进一步的困难，出现多个过渡之间的细胞和生物组织的光学系统的其余部分之间的空域和细胞成分，折射率叶肉组织。此外，折射率不匹配导致荧光激发和荧光显微镜所排放的信号衰减。我们在这里描述的应用程序的全氟化碳，全氟萘烷（PFD），浸润成像介质光学提高激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）样品成像深度，而不采取激光功率的损害增加，和最小的生理影响2。我们描述了PFD的使用拟南芥叶组织，这是光作为其结果的复杂的协议结构（ 图1）。 PFD的有属性，使之适合使用本3。 PFD的折射率（1.313）与水（1.333）相比和细胞质（约1.4），比空气（1.000）。此外，PFD的是现成的，无荧光，是无毒的。 PFD的低表面张力（19达因厘米-1）低于水（72达因厘米-1），也低于气孔渗透，这使得它洪水的限制（25 - 30达因厘米-1）海绵叶肉空域没有一个潜在的破坏性的真空或表面活性剂的应用。最后，至关重要的是，PFD的大容量为溶解的CO 2和O 2，它允许气体交换，以保持在洪水淹没的组织，从而最大限度地减少对样本的生理影响。这些属性已被用于各种应用，其中包括部分液体呼吸和肺inflaTION 5,6，7手术，人造血液，增长充氧媒体9，和冰晶体的形成在植物10研究。目前，它是常见的，安装在现场共焦成像的水或缓冲溶液的组织。我们认为，作为安装介质的使用PFD的代表对改善现行的做法，使整个成像活叶样品制备简单。
Protocol
下面给出的协议描述了一个简单的方法，使用PFD的浸润安装在拟南芥叶片中等，但我们预计，这种方法可用于成像空气丰富的组织需要的各种应用。
1。安装在PFD的叶样品
- 准备透气垫片的二甲基硅氧烷（PDMS，卡罗来纳州观察凝胶）载玻片。硅橡胶是一种粘弹性聚合物，可以被塑造提供符合实验要求一腔。
- 与空气平衡PFD的。这可能是实现与空气气泡或晃动PFD功能，在一个充满空气的瓶子体积小。
- 倒出PFD的一个开放的培养皿中，并飘起了一个全苗或PFD的叶切除5分钟。该组织应成为半透明，让人联想到玻化组织（图2（a） ）。叶可能会出现比之前曝光变暗或更轻PFD的，依赖丁照明条件和年龄组织使用。
- 与空气平衡的PFD填充PDMS室，仔细从孵化培养皿转移的PDMS厅组织样本。盖玻片和形象，根据实验要求密封的幻灯片。
- 注：PFD的也表现出良好的盖玻片上构建了一个开放室或在灌注室和兼容硅脂。 PFD的聚四氟乙烯组件不兼容，因为它溶解。
2。代表性的成果：
PFD孵育叶标本的显微镜检查显示，大部分空域充斥。图2（b）显示在PFD的暂停重组的GFP淹没的空域。很明显，叶与PFD的潜伏期后淹没，但偶尔口袋里的空气可能会保持。水不洪水在这些条件下的叶。培养和安装在样品的激光扫描共聚焦显微镜红外，水或PFD显示，PFD的给出了一个对水和空气的优势可能在成像深度（ 图3）。在图3给出的例子表明，空气，水和PFD 安装拟南芥叶表达cytosolically本地化金星，表示35S启动子下组成了 11 YFP的变种。比较PFD和水时，我们可以看到成像深度约2倍。但是，应该指出，使用PFD时看到精确的改善与数值孔径的镜头和使用的组织类型不同。我们已经看到细胞质流PFD的治疗苗发根伸长，每个健康植物的指示。此外，我们有2所示，Fv / Fm的 ，12植物光合运作的措施仍然在成像使用的时间表，容忍的限度内。
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图1。植物叶的复杂性和光的影响
图解代表性的A.解剖特点拟南芥叶光学设置。 OBJ的缩写。 =物镜，入境事务处处长。 =浸入液体，覆盖。 =盖玻片，产妇和新生儿破伤风。 = mountant，切。 =角质层，广告。 EP。 =近轴面表皮，ST。 =气孔孔径，SP。 =海绵叶肉，=空气空间，PAL。 =栅栏叶肉，VB =维管束，广告。 EP。 =近轴表皮。细胞壁是由黑线表示。
图2。 PFD的容易渗透拟南芥叶
（一）培养叶片在空气，水或5分钟PFD的成像徕卡DCF3000FX数码相机使用徕卡MZ16F显微镜（莱卡微系统（英国）有限公司，米尔顿凯恩斯，英国）。朱庇特的标志印在醋酸纤维膜和照明来回米以下的灯箱。曝光时间为89毫秒，所有图像采集和处理相同。标尺代表2毫米。
（二）携带PFD的纯化的重组绿色荧光蛋白（GFP）分隔体内的空域。 GFP是假的绿色，红色是用来显示自体荧光，分隔叶肉细胞叶绿素。 （ 图2（b），权限和Littlejohn等提供全面的技术细节再现。2010年2 ）。标尺代表25米。
图3。 PFD的提高叶片中的共焦成像
激光共聚焦显微镜图像显示cytoplasmically本地化金星荧光（绿色）和叶绿素的自发荧光（红色）在完整的拟南芥叶片在空气，水或PFD成像。激发波长为514 nm和荧光光谱在518纳米金星为604纳米和657纳米679纳米为叶绿体。每个小组是一个单一的焦节从11每隔5微米收购的激光共聚焦图像的Z - Stack。分别提取59影像在1微米的间隔，并已用于生产补充电影获得一个完整的Z - Stack的。深度测量相对于表皮的表面。代表图像，这是相同的处理，显示。实验细节，如显微镜设置在Littlejohn等人 ，2010年2发现的相同。 Scalebars代表20微米。
Discussion
这是一个简单和易于使用的技术，以提高显微镜充满空气或光学复杂的组织。我们已经表明，该技术有一些具有很强的优势，我们希望这将是用于澄清有关空气丰富组织的生物学问题。例如，这将是一个研究植物叶肉或肺部的病原体攻击的自然选择。我们也意识到该技术的局限性。我们更好的折射率匹配工作，使用其他交通工具显微镜，并在较长的时间尺度实验的全氟化碳mountant增资。我们还认识到，虽然PFCs的主要优点之一，即生物惰性有一个不利的一面。 PFCs的不容易溶解的生物分子，这也意味着，他们不能很容易地用来提供利益，如激素，药物和其他小分子或离子的化合物。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢他的意见和埃克塞特大学的生物成像设施的埃克塞特大学教授尼古拉斯米尔诺夫。经费是由英国生物技术和生物科学研究理事会（赠款参考BB/E002682/1）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J. Properties of perfluorinated liquids. Fed. Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).
- Schönherr, J., Bukovac, M. J. Penetration of stomata by liquids. Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).
- Davies, M. W. Liquid ventilation. Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
