Summary
Vi beskriver användningen av perfluorodecalin som en infiltrativ monteringsmedel. Detta är en enkel metod för att förbättra djup avbildning i
Abstract
Problemet med att skaffa högupplösta bilder djupt in i biologiska prover är allmänt erkänt 1. I luftfyllda vävnad såsom den svampiga mesophyll växt löv eller ryggradsdjur lungor ytterligare svårigheter uppstå från flera övergångar i brytningsindex mellan cellulära komponenter, mellan celler och luftrum samt mellan biologisk vävnad och resten av det optiska systemet. Dessutom brytningsindex obalans leder till dämpning av fluoroforen excitation och signal utsläpp i fluorescensmikroskopi. Vi beskriver här tillämpningen av perfluorkarbon, perfluorodecalin (PFD), som ett infiltrativ avbildning medium som optiskt förbättrar laserskanning konfokalmikroskopi (LSCM) prov bildhantering på djupet, utan att ta till skada ökar i laser makt och har minimal fysiologisk effekt 2. Vi beskriver protokollet för användning av flytväst med Arabidopsis thaliana bladvävnad, som är optiskt komplex som ett resultat av dessstruktur (figur 1). PFD har ett antal egenskaper som gör den lämplig för användning 3. Den brytningsindex PFD (1,313) är jämförbar med den i vatten (1,333) och är närmare den cytosolen (ca 1,4) än luft (1,000). Dessutom är flytväst lätt tillgängliga, icke-lysrör och är giftfri. Den låga ytspänningen i PFD (19 dynes cm -1) är lägre än vatten (72 dynes cm -1) och även under gränsen (25 till 30 Dyne cm -1) för stomatakonduktans penetration 4, vilket gör att den översvämning den svampiga mesophyll luftrum utan tillämpning av en potentiellt destruktiv vakuum eller tensider. Slutligen och viktigast, har flytväst en stor kapacitet för att lösa CO 2 och O 2, som tillåter gasutbyte måste behållas i den översvämmade vävnaden, vilket skulle minimera fysiologiska påverkan på provet. Dessa egenskaper har använts i olika applikationer som inkluderar delvis flytande andnings-och lung-inflationention 5,6, kirurgi 7, konstgjort blod 8, syresättning av tillväxt Media 9, och studier av is kristaller bildas i växter 10. För närvarande är det vanligt att montera vävnad i vatten eller buffert för live konfokala avbildning. Vi anser att användningen av flytväst som monteringsmedium är en förbättring av befintlig praxis och tillåter enkel bearbetning av levande hela blad prover för avbildning.
Protocol
Protokollet anges nedan beskriver en enkel metod för att använda flytväst som en infiltrativ monteringsmedium i Arabidopsis thaliana blad, men vi räknar med att denna metod kan användas i en mängd olika applikationer där imaging luft-rika vävnader önskas.
1. Montering blad prover i PFD
- Förbered ett objektsglas med en gas permeabla packning av Polydimetylsiloxan (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS är en viskoelastisk polymer och kan formas för att ge en kammare anpassad till experimentella krav.
- Jämvikt PFD med luft. Detta kan uppnås genom att bubblande med luft eller genom att skaka en liten volym av flytväst i en luft-fylld flaska.
- Dekantera PFD till en öppen petriskål och flyta hela plantor eller utskurna blad på flytväst i 5 minuter. Vävnaden ska bli genomskinliga, som påminner om förglasat vävnad (Figur 2 (a)). Löv kan visas mörkare eller ljusare än tidigare exponering för flytväst, beroendeding på ljusförhållanden och ålder av vävnad som används.
- Fyll PDMS kammare med luft-jämvikt PFD och noggrant överföra vävnadsprover från inkubering petriskålen till PDMS kammaren. Täta bilden med ett täckglas och bild enligt experimentella krav.
- Obs: PFD också presterar bra i en öppen kammare konstrueras på ett täckglas eller i en perfusion kammare och är kompatibel med fett. PFD är inte förenligt med Teflon komponenter som den löser upp dem.
2. Representativa resultat:
Mikroskopisk kontroll av PFD ruvade blad prover visar att majoriteten av luftrum är översvämmade. Figur 2 (b) visar luftrum översvämmad med rekombinant GFP svävande i PFD. Det är uppenbart att bladet är översvämmad efter inkubation med flytväst, men att enstaka luftfickor kan finnas kvar. Vatten har översvämning inte bladet under dessa förhållanden. LSCM av prov inkuberas och monteras i en ir, vatten eller PFD visar att PFD ger ett övertag över vatten och luft i djupet av imaging möjligt (Figur 3). De exempel som ges i figur 3 visar luft, vatten och flytväst monteras Arabidopsis lämnar uttrycka cytosolically lokaliserad Venus, en variant av YFP 11 som uttrycks konstitutivt under 35S promotorn. Vi kan se en ungefärlig 2-faldig ökning av djup avbildning när man jämför PFD och vatten. Noteras bör dock att den exakta förbättring ses när du använder flytväst varierar med numeriska bländaröppningen på objektivet och den typ av vävnad som används. Vi har sett cytoplasmiska streaming och rot hår förlängning i flytväst behandlade plantor, varje tecken på friska plantor. Dessutom har vi visat 2 att Fv / FM, ett mått på den fotosyntetiska fungerande anläggningar 12 håller sig inom acceptabla gränser över tidsskalor som används i bildbehandling.
3394fig1.jpg "/>
Figur 1. Växters blad komplexitet och optiska konsekvenser
Schematisk representation visar anatomiska funktioner i A. thaliana blad i förhållande till det optiska set-up. Förkortningar är obj. = Objektiv, IMM. = Nedsänkning vätska, cov. = Täckglas, mnt. = Monteringsvätska, skär. = Nagelband, ad. ep. = Adaxial epidermis, st. = Stomatakonduktans pore, sp. = Svampiga mesophyll, som = luftrum, PAL. = Palissad mesophyll, VB = vaskulär bunt, ad. ep. = Adaxial epidermis. Cellväggarna är markerade med svarta linjer.
Figur 2. PFD penetrerar lätt Arabidopsis löv
(A) Lämnar inkuberas i luft, vatten eller flytväst i 5 minuter och avbildas med en Leica DCF3000FX digitalkamera med en Leica MZ16F mikroskop (Leica Microsystems (Storbritannien) Ltd, Milton-Keynes, Storbritannien). Jové logotyp tryckt på acetat film och belyst tillbakam under med en ljuslåda. Exponeringstiden var 89 ms och alla bilder har samlats in och bearbetats på samma sätt. Skala stapel 2 mm.
(B) PFD bär renat rekombinant grönt fluorescerande protein (GFP) avgränsar luftrum in vivo. GFP är falsk färgat grönt och rött används för att visa klorofyll auto-fluorescens, som avgränsar mesophyll celler. (Figur 2 (b) återges med tillstånd och fullständiga tekniska detaljer som finns i Littlejohn et al. 2010 2). Skala stapel avser 25 m.
Figur 3. PFD förbättrar konfokala imaging i bladen
LSCM bilder som visar cytoplasmically lokaliserade Venus fluorescens (grön) och klorofyll autofluorescens (röd) i intakta A. thaliana löv avbildas i luft, vatten eller PFD. Excitationsvåglängden var 514 nm och fluorescens utsläpp spelades in vid 518 nm 604 nm för Venus och vid 657 nm679 nm för kloroplaster. Varje panel är en enda konfokala avsnitt tas från en Z-bunt med 11 konfokala bilder förvärvades till 5 ìm mellanrum. Dessa var ur en full Z-bunt med 59 bilder förvärvades 1 mikrometer intervall, som har använts för att producera ytterligare filmer. Djup mätningar i förhållande till den epidermala ytan. Bilderna är, som bearbetats på samma sätt, visas. Experimentell detaljer såsom mikroskop inställningar är identiska med dem som finns i Littlejohn et al. 2010 2. Scalebars representerar 20 mikrometer.
Discussion
Detta är en enkel och lätt att använda tekniken för att förbättra mikroskopi av luftfyllda eller optiskt komplex vävnader. Vi har visat att tekniken har några starka fördelar och vi hoppas att det kommer att användas för att belysa biologiska frågor som rör luft-rik vävnader. Till exempel skulle det vara ett naturligt val för studier av patogener attack i fabriken mesophyll eller i lungorna. Vi är också medvetna om de begränsningar av tekniken. Vi arbetar för bättre brytningsindex matchning, användning med andra typer av mikroskopi och perfluorkarbon monteringsvätska påfyllning under långa tidsperiod experiment. Vi inser emellertid också att en av de största fördelarna med PFC, nämligen att vara biologiskt inert har en flipside. PFC inte löses upp lätt biologiska molekyler som också innebär att de inte lätt kan användas för att leverera föreningar av intresse, till exempel hormoner, droger, och andra små molekyler eller joner.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka professor Nicholas Smirnoff på University of Exeter för hans råd och University of Exeter Bioimaging Facility. Finansiering gavs av det brittiska bioteknik och Biological Sciences Research Council (bidrag referens BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
