Summary
Colloidi d'oro Alkanethiolate stabilizzata nota come cluster monostrato protetta (MPC) sono sintetizzati, caratterizzati e assemblati in film sottili come interfaccia per adsorbimento elettrochimica monostrato proteina di semplici proteine redox come
Abstract
Oro colloidale delle nanoparticelle protette con leganti alkanethiolate chiamato cluster d'oro monostrato protette (MPC) sono sintetizzate e successivamente incorporata in assembly film che fungono da piattaforme adsorbimento per l'elettrochimica di proteine monostrato (PME). PME è utilizzato come sistema modello per lo studio delle proprietà elettrochimiche di proteine redox mediante il loro confinamento una piattaforma di adsorbimento a un elettrodo modificato, che serve anche come partner redox di trasferimento elettronico (ET) reazioni. Studi hanno dimostrato che nanoparticelle d'oro assemblee film di questo genere prevede un ambiente più omogeneo l'assorbimento di proteine e promuovere ET senza dipendenza distanza rispetto ai sistemi più tradizionali, modificati con alkanethiol monostrati auto-assemblati (SAM). 1-3 In questo lavoro, PPM funzionalizzati con leganti hexanethiolate sono sintetizzati utilizzando una reazione Brust modificato 4 e caratterizzato con spettroscopia UV visibile (UV-Vis), microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e protone (1 H), risonanza magnetica nucleare (NMR). MPC film sono montati su oro interfacce elettrodo SAM modificato utilizzando un "ciclo tuffo" metodo di strati alternati MPC e ditiolo molecole di collegamento. Crescita del film a elettrodo d'oro viene monitorato elettrochimicamente misurando i cambiamenti a doppio strato corrente di carica del sistema. Film analoghi montati su vetrini silano modificato per permettere il monitoraggio ottica di crescita di film e analisi trasversale TEM fornisce una stima dello spessore del film. Durante il montaggio cinematografico, la manipolazione della protezione ligando MPC così come il meccanismo di collegamento interparticellare consentire film in rete, che sono facilmente adattabili, per interfacciarsi con le proteine redox aventi differenti meccanismi di adsorbimento. Per esempio, Pseudomonas aeruginosa azurina (AZ) può essere adsorbito idrofobicamente a ditiolo-linked film di PPM hexanethiolate e citocromo c (citocromo c) può essere immobilizzato elettrostaticamente ad un acido carbossilico modificato strato interfacciale MPC. In questo rapporto, ci concentriamo sul protocollo film per il sistema di AZ esclusivamente. Le indagini che coinvolgono l'assorbimento di proteine su MPC piattaforme modificato sintetico potrebbe ulteriormente la comprensione delle interazioni tra biomolecole e materiali artificiali, e di conseguenza favorire lo sviluppo di sistemi di biosensori, ET sistemi di modellazione e materiali sintetici biocompatibili. 5-8
Protocol
1. Hexanethiolate monostrato Protetta di sintesi Oro Clusters
Hexanethiolate funzionalizzati cluster d'oro monostrato protette (PPM) sono sintetizzati seguendo un 2:1 1-hexanethiol (C6) rapporto tra mole d'oro per la produzione di una struttura media di Au 225 (C6) 75. 4-9 modifiche specifiche per la reazione Brust, come trattamenti di tipo ligando, specifiche tiolo-to-oro rapporti, temperatura, velocità di reazione e la consegna, o post-sintesi, 9-11 possono produrre una vasta gamma di PPM con dimensioni variabili fondamentali e funzionali dei gruppi di protezione, rispettivamente. 4 La approssimativo MPC ( media) composizioni di PPM funzionalizzati con vari gruppi alkanethiol può essere determinato da protone (1 H), risonanza magnetica nucleare (NMR) analisi di iodio-decomposto campioni.
- Sciogliere 1,1 g di bromuro tetraoctylammonium (TOABr) in 30 mL di toluene con opportuna ventilazione cappa.
- Sciogliere 0,38 g di sodio boroidruro (NaBH 4) in ~ 20 ml d'acqua di 18 MΩ ultrapurified (UP H 2 O) e lasciare raffreddare con ghiaccio per almeno 30 min.
- Sciogliere 0,31 g di idrogeno tetrachloroaurate cloraurico (HAuCl4) in ~ 20 ml di UP H 2 O e trasferire quantitativamente la miscela soluzione al TOABr-toluene soluzione utilizzando un ulteriore ~ UP 5 ml di H 2 O, per trasferimento di fase acquosa l'oro soluzione alla soluzione nonaqueous. Mescolare rigorosamente mentre leggermente ricoperto per 30 min in modo che il colore arancione bruciato fasi acquose e chiare nonaqueous sono mescolando bene.
- Trasferimento sia il acquosa chiara e arancione bruciato fasi nonaqueous ad un imbuto separatore. Eliminare il acquosa (in basso) livello e decantare il nonaqueous (in alto) livello in un vasetto pulito.
- Aggiungi C6 in un rapporto di 2:1 con HAuCl 4 per la soluzione nonaqueous. Mescolare per 30 minuti per formare una (I) Au polimero, come rilevato da un cambiamento di colore da arancio rossastro ad un giallo pallido, quasi incolore soluzione.
- Trasferire la miscela di reazione a un bagno di ghiaccio isolato e freddo a 0 ° C per almeno 30 minuti mescolando.
- Quantitativamente e aggiungere rapidamente il freddo NaBH 4 soluzione alla miscela di reazione in modo da ridurre Au (I) per un oro metallico in presenza di tioli, istantaneamente formando una soluzione spessa nera dopo l'aggiunta di PPM. Mescolare reazione notte a 0 ° C.
- Trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore, eliminare l'acqua (basso) livello in un bicchiere di rifiuti, e rotante evaporare l'nonaqueous (in alto) strato di toluene vicino a secchezza completa lasciando un fango pesante nero nel pallone.
- Precipitare la PPM con l'aggiunta di acetonitrile e permettendo di sedersi durante la notte.
- Raccogliere PPM filtrazione sotto vuoto con una fritta di vetro di media porosità con raccordi in gomma e side-armati pallone con aspiratore e sciacquare con abbondante acetonitrile.
- Lasciare asciugare all'aria PPM, pesare prodotto, caratterizzano da microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e analisi NMR, e conservare ricoperto per un uso futuro. Ottenere immagini TEM a goccia-casting PPM disciolti in toluene su formvar / sostegno al cinema di carbonio sulla griglia di rame (400 mesh) e il funzionamento dello strumento TEM a 80-100 kV. La dimensione del nucleo medio può essere stimato utilizzando un software di analisi dell'immagine come immagine J (freeware).
2. Film di montaggio: ditiolo-linked Assemblea Film MPC per Elettrochimica proteine monostrato
Il substrato d'oro è il primo elettrochimicamente pulita e modificata con un SAM C6 prima di immergere in alternanza soluzioni di ditiolo molecole di collegamento e PPM C6 modificato per renderlo un "ciclo tuffo", che è ripetuto più volte a formare in definitiva un ditiolo-linked film di montaggio MPC . Come descritto in precedenti studi, 2 il plasmide originale per il Pseudomonas aeruginosa azurina (AZ) proteina è stata gentilmente data dal Dott. Corey Wilson della Rice University e AZ è stato fornito come polvere liofilizzata e purificata dalla University of Richmond professore, il dottor Jonathan Dattelbaum, che è stata successivamente reidratato con 4,4 mM tampone fosfato di potassio (KPB, pH = 7.0, μ = 10 mm) per creare una soluzione di 5-10 mM, come verificato dai raggi ultravioletti analisi visibile (UV-Vis).
- Assemblare la (ECHEM) delle cellule elettrochimiche panino nel seguente ordine dal basso verso l'alto: il primo piatto fermo Lucite, substrato di oro come un elettrodo di lavoro, il contatto elettrico in ottone a elettrodo d'oro di lavoro, in primo luogo guarnizione in gomma, Viton o-ring che definisce la superficie degli elettrodi (0,32 cm 2), corpo in vetro cellulare, guarnizione in gomma secondo, e il secondo piatto fermo Lucite. L'intera cella è tenuto insieme da barre filettate e accuratamente serrati galletti. La cella è dotata di un elettrodo di riferimento acquistabile sul mercato che ospita una botte di vetro con 1 M KCl saturo, Ag / AgCl filo di riferimento, e un ausiliario filo elettrodo Pt.
- Elettrochimicamente ° pulitae substrato di oro eseguendo voltammetria ciclica (CV) nelle finestre potenziale 0,2-0,9 V, da 0,2 a 1,2 V e 0,2-1,35 V (vs Ag / AgCl, KCl) a 100 mV / s in una soluzione di 0,1 MH 2 SO 4 e 0,01 M KCl.
- Misurare la corrente di carica del substrato pulito oro nudo eseguendo CV a "condizioni standard", tra cui una finestra potenziale 0,1-0,4 V (vs Ag / AgCl, KCl) scansionato a 100 mV / s in KPB 1. KPB Scarta e risciacquare successivamente con UP H 2 O, etanolo (EtOH), UP H 2 O, e EtOH.
- Esporre il substrato di oro pulito a ~ 300 ml di soluzione al 5 C6 mM in EtOH e lasciar riposare tutta la notte per formare un ordinato C6 SAM. Scartare la soluzione C6 dalla cella e risciacquare successivamente con EtOH, UP H 2 O, EtOH, e UP H 2 O.
- Misurare la corrente di carica del SAM a condizioni standard. Gettare KPB e risciacquare successivamente con UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, e EtOH. La corrente di carica dovrebbe essere notevolmente diminuito da quello della misurazione oro nudo (passo 2.3) 1.
- Esporre l'oro SAM modificato substrato ~ 300 ml di 5 mM 1,9-nonanedithiol (NDT) una soluzione EtOH e lasciare riposare per 1 ora a interdisperse NDT che collega le molecole all'interno del SAM C6. Scartare la soluzione NDT e risciacquare abbondantemente e successivamente con EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, e il cloruro di metilene (CH 2 Cl 2).
- Esporre il substrato di oro ad una soluzione PPM di CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) con agitazione lentamente spumeggiante con N 2 gas per 1 ora. Se necessario, sostituire evaporato soluzione MPC con più CH 2 Cl 2. Questo è lo strato di ancoraggio PPM dell'assemblea film. Scartare la soluzione MPC e di nuovo lavare successivamente con CH 2 Cl 2, UP H 2 O, e KPB.
- Misurare la corrente di carica dello strato di MPC a condizioni standard. Gettare KPB e risciacquare successivamente con UP H 2 O e CH 2 Cl 2.
- Esporre il substrato di oro a ~ 300 ml di soluzione al 5 NDT mM di CH 2 Cl 2 con agitazione lentamente spumeggiante con N 2 gas per 20 min.
- Gettare NDT e risciacquare abbondantemente con CH 2 Cl 2. Ripetere i passi 2.7 e 2.8 per depositare il secondo strato MPC dell'assemblea film.
- Per depositare ulteriori strati MPC, passi 2.9 e 2.10 si ripetono. Con ogni ulteriore livello MPC un corrispondente aumento della corrente di carica è osservato.
- Dopo il film in rete MPC è completa, risciacquare il substrato pellicola modificato con KPB. AZ proteina è adsorbita sul montaggio cinematografico MPC, iniettando circa 150 ml di soluzione di 5-10 mM AZ ~ di KPB nella cella panino ECHEM e consentendo di sedersi innevate e refrigerati per almeno 1 ora.
- Rimuovere la cella ECHEM dal frigorifero e lasciarlo ritornare a temperatura ambiente vicino. Sciacquare accuratamente con KPB, ricarica cellulare ECHEM con KPB, e bolla KPB con N 2 gas per 10 min.
- Proteine monostrato studi elettrochimici sono eseguiti come CV nella finestra di potenziali -0,25 V a 0,25 V (contro Ag / AgCl, KCl) scansionato a 100 mV / sec in KPB.
3. Film di montaggio: ditiolo-linked Assemblea Film MPC per il tracciamento ottico
Prima di crescente film MPC per la valutazione ottica, le sezioni vetrino sono pre-lavati con soluzione Piranha (ATTENZIONE! 02:01 concentrato H 2 SO 4 e H 2 O 2) e trattati con (3-mercaptopropyl)-trimetossisilano (3-MPTMS ). 1-2 film MPC vengono poi montate su queste diapositive di vetro modificato con la tecnica del "dip ciclo" come già descritto sopra.
- Sciacquare un 3-MPTMS vetrino modificato con CH 2 Cl 2 e mettetelo in una soluzione PPM di CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) per 1 ora mentre agita su un agitatore a bassa velocità. Questo completa il primo strato MPC dell'assemblea film di ancoraggio PPM al endgroups mercaptani del silano. Sciacquare il vetrino accuratamente con CH 2 Cl 2, e asciugare con N 2 gas. Prendete un spettro UV-Vis (da 400 a 1000 nm) della diapositiva, e sciacquare ancora con CH 2 Cl 2.
- Mettere il vetrino in una soluzione NDT 5 mm di CH 2 Cl 2 per 1 ora mentre agita su un agitatore a bassa velocità. Sciacquare il vetrino con CH 2 Cl 2.
- Mettere il vetrino in una soluzione PPM per 1 ora mentre agita su un agitatore a bassa velocità. Questo completa il secondo strato MPC dell'assemblea film. Sciacquare il vetrino accuratamente con CH 2 Cl 2, secca con N 2 gas, e prendere un spettro UV-Vis (da 400 a 1000 nm) della diapositiva. L'assorbanza per tutta la gamma dovrebbe essere in aumento, ulteriori strati di MPC sono assorbiti per il montaggio del film.
- Per depositare ulteriori strati MPC, steps 3,2-3,3 si ripetono.
4. Caratterizzazione di monostrato Protetta Oro Assemblee Film cluster da Croce sezionali Transmission Electron Microscopy
TEM sezioni sono preparati da riaggregazione faccia en film incorporato. 2, 12 Questo viene fatto per prima cosa attaccare un film MPC montato su una 3-MPTMS vetrino modificato su un panno microscopio standard di diapositive usando Incorpora 812 resina epossidica per consentire migliorata la gestione durante la procedura di seguito. Prestare attenzione con il calore applicato come temperature più elevate si decompone PPM all'interno del film.
- Mix Incorpora 812 resina epossidica e lasciare addensare per almeno 12 ore.
- Riempire una capsula "00" Beem con resina epossidica e capovolgere in cima alla pellicola campione MPC (preparata nella sezione 3). Mettere pressione sulla capsula in modo che una bolla sorge in cima alla capsula, creando una guarnizione tra la resina epossidica e campione pellicola MPC. Lasciare polimerizzare per almeno 18 ore a 60 ° C e poi raffreddare le diapositive montate a temperatura ambiente.
- Calore diapositive montate per 20 sec su una piastra in alluminio caldo a 200 ° C per facilitare la rimozione del blocco con allegata faccia pellicola MPC it.
- Tagliare il campione contenente il film fuori del blocco capsula Beem utilizzando visto un gioielliere.
- Incorporare nuovamente la parte rimossa in uno stampo in silicone piatto con il lato pellicola MPC fino rivolto verso l'interno del silicio bene. Riempire il silicio e con resina epossidica a temperatura ambiente e lasciare polimerizzare per almeno 18 ore a 60 ° C. Raffreddare il campione a temperatura ambiente.
- Ottenere sezioni sottili campione di 60-80 nm su un UCT Leica ultramicrotomo utilizzando un coltello di diamante per tagliare sezioni perpendicolare al bordo del coltello.
- Luogo fette sezioni su formvar / sostegno al cinema di carbonio sulla griglia di rame (400 mesh) e prendere le immagini TEM di preparato sezioni di assemblee pellicola MPC.
5. Rappresentante dei risultati:
Figura 1 Doppio strato di carica monitoraggio attuale di crescita pellicola MPC per un totale di 5 cicli di immersione (alternando l'esposizione al MPC e soluzioni NDT). Corrente di carica aumentato sistematicamente con ogni ciclo di immersione, aggiungendo "strati" del MPC al film (Fig. 2). Il voltammograms ciclica sono stati raccolti utilizzando una finestra potenziale 0,1-0,4 V (contro Ag / AgCl, KCl) scansionato a 100 mV / s in 4,4 mM tampone fosfato di potassio (pH = 7.0, μ = 10 mm). Ristampato con il permesso di ML Vargo, Gulka CP, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lorenzo, ML Trawick, e MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 2 (a) Rappresentazione schematica di proteine AZ adsorbito ad un ditiolo-linked film di montaggio MPC. (B) voltammogram ciclico tipico per AZ assorbiti da MPC film di montaggio raccolti utilizzando una finestra potenziale da -0,25 a 0,25 V (vs Ag / AgCl, KCl) scansionato a 100 mV / s in 4,4 mM tampone fosfato di potassio (pH = 7.0, μ = 10 mm).
Figura 3 Rappresentante UV-Vis monitoraggio spettrale di una ditiolo-linked crescita del film MPC in un 3-MPTMS vetrino modificato. Un ciclo è costituito da un tuffo esposizione del vetrino di NDT soluzione linker seguito un'esposizione alla soluzione MPC. Ogni tuffo risultati successivi in crescita dello spessore del film e un aumento di assorbanza concorrente. Poiché il numero di cicli di immersione aumenta, la band plasmone di superficie è gradualmente definita a ~ 520 nm. Ristampato con il permesso di ML Vargo, Gulka CP, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lorenzo, ML Trawick, e MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 4 microscopia elettronica a trasmissione (TEM) della sezione trasversale di analisi delle immagini di un ditiolo-linked film di montaggio MPC. Inset: immagine TEM tipici di hexanethiolate PPM funzionalizzati utilizzate per l'assemblaggio film. Analisi TEM determinato una media diametro del nucleo d'oro dei PPM da ~ 2 nm con J analisi delle immagini. Ristampato con il permesso di ML Vargo, Gulka CP, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lorenzo, ML Trawick, e MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
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Discussion
Monostrato elettrochimica proteina è una tecnica efficace utilizzata per studiare le interazioni tra proteine redox e sintetiche piattaforme di adsorbimento. L'efficacia di questa strategia, tuttavia, dipende dalla capacità di progettare un'interfaccia adsorbimento con un alto grado di controllo a livello molecolare. Il MPC piattaforme basate su creato da questo protocollo rappresenta piattaforme specificamente progettate che sono in grado di offrire un ambiente più omogenea delle proteine 3 e facilitare ET su una distanza maggiore 2 rispetto ai sistemi tradizionali impiegando PME SAM alkanethiolate. Un punto di forza del film di montaggio MPC come interfaccia elettrochimica è la sua versatilità e adattabilità ad altre proteine redox di varie dimensioni e superficie chimica / funzione, vari nanomateriali diversi, e configurazioni di elettrodi si alternano pure. Per esempio, la procedura descritta è facilmente adattabile agli studi ET del citocromo c (citocromo c) mediante semplice luogo di scambio reazioni sullo strato più esterno del PPM incorporato nel montaggio. 11 Come citocromo c è cationica ed è in grado di legarsi al substrato elettrostaticamente, carbossilico terminata tioli alkanethiols può essere posto-scambio nel ligandi periferico di PPM, compresa l'interfaccia elettrodo modificato per facilitare una immobilizzazione elettrostatica guidata della proteina, con la successiva analisi elettrochimica essere identica a quella descritta qui. 1 Per regolare la dimensioni dei PPM per ospitare diverse dimensioni delle proteine, alle registrazioni di sintesi Brust, come la modifica tiolo-to-oro rapporti, la reazione di temperatura / velocità di consegna, produrre una vasta gamma di diametri MPC che corrisponderà al diametro approssimativo di una proteina bersaglio . 9-10
La procedura generale, in primo luogo i cicli ripetitivi di esposizione a particelle e molecole di collegamento (layer-by-layer) è stato usato con successo per creare film sottile che incorpora una varietà di nanomateriali diversi. Per esempio, le nanoparticelle acquosa (PN) con differenti rivestimenti protettivi ed unica proprietà ottiche sono stati collegati in film che sono collegati esclusivamente con interazioni elettrostatiche tra NP e ponti polielettrolita. 13 La stessa strategia è stata applicata anche alla costruzione di pellicola altamente sensibile otticamente assemblee con nano o NP guscio vuoto.
Mentre la procedura descritta qui utilizza celle progettate su misura elettrochimiche e substrati d'oro, è facilmente adattabile a elettrodi più generico, configurazioni elettrochimiche e tecniche elettroanalitiche. Oltre a tutti i film descritti poter essere costruito su elettrodi d'oro evaporato e diapositive di vetro, i film sono stati facilmente assemblati su elettrodi comune disco d'oro che sono facilmente reperibili da strumenti CH o sistemi bioanalitici (BAS). Anche se voltammetria ciclica continua ad essere la principale tecnica elettrochimica in PME, abbiamo recentemente analizzato con successo monostrato proteine ET con una varietà di altre tecniche elettrochimiche, tra cui passo, il polso, e impedenza tecniche basate 14.
Ricerca e sviluppo di nanomateriali a base di interfacce per l'assorbimento delle proteine, ma sono in corso le assemblee pellicola MPC descritti in questo rapporto rappresentano una strategia efficace e migliorato per gli studi di PME. La procedura è relativamente semplice e può essere effettuata da studenti e scienziati di tutti i livelli, la creazione di film altamente versatile che può essere facilmente adattati alle proteine target specifici, se necessario.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine la National Science Foundation (CHE-0847145), e la Henry Dreyfus Teacher-Scholar Awards Program per sostenere generosamente questa ricerca. Vorremmo riconoscere specificamente Christine Davis, direttore di Microscopia e Imaging presso il Dipartimento di Biologia presso l'Università di Richmond per la sua assistenza con cross-sectional imaging. Un ringraziamento speciale è dato a Drs. T. Leopoldo, Caso R. Kanters, D. Kellogg, R. Miller, e W., così come, Russ Collins, Phil Giuseppe, Carolyn Marks, Mandy e John Mallory Wimbush - i quali rendono possibile la ricerca di laurea presso l'Università di Richmond. Un personalissimo ringraziamento è dato a tutti gli attuali, i ricercatori passati e futuri di laurea nel laboratorio di ricerca Leopoldo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraoctylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 294136 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Hydrogen tetrachloroaurate | Sigma-Aldrich | 254169-5G | |
| 1-Hexanethiol | Sigma-Aldrich | 234192 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | 1010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | Bruker Corporation | 300 MHz | |
| Formvar/carbon support film on copper grid (400 mesh) | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | |
| Gold substrate | Evaporated Metal Films Corp. | Custom | |
| Ag/AgCl Reference electrode | Microelectrodes, Inc. | MI-401F | |
| Potentiostats | CH Instruments, Inc. | CHI650A, CHI610B | |
| 1,9-Nonanedithiol | Sigma-Aldrich | N29805 | |
| (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Agilent Technologies | 8453 | |
| Embed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| "00" BEEM capsule | Electron Microscopy Sciences | 70000-B | |
| Silicon flat mold | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Diamond knife | Diatome | 21-ULE, S12801 |
References
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