Summary
Alkanethiolate estabilizado coloides de oro conocidos como clusters monocapa protegidas (PSM) se sintetizan, que se caracteriza, y montados en láminas delgadas como una interfaz de adsorción de la electroquímica de proteínas monocapa de proteínas redox sencillas como
Abstract
Nanopartículas de oro coloidal protegidos con ligandos alkanethiolate llamada monocapa protegidos racimos de oro (PSM) se sintetizan y se incorporaron posteriormente en las asambleas de cine que sirven como plataformas para la adsorción electroquímica de proteínas monocapa (PME). PME se utiliza como sistema modelo para estudiar las propiedades electroquímicas de las proteínas redox mediante su confinamiento a una plataforma de adsorción a un electrodo modificado, que también sirve como un socio redox de transferencia de electrones (ET), las reacciones. Los estudios han demostrado que el oro asambleas película de nanopartículas de este tipo proporcionan una proteína más homogéneo el medio ambiente y promover la adsorción de ET, sin dependencia de la distancia en comparación con los sistemas más tradicionales modificados con alcanotiol monocapas autoensambladas (SAM). 1.3 En este documento, los países socios mediterráneos funcionalizadas con ligandos hexanethiolate son sintetizados mediante una reacción Brust modificado 4 y se caracteriza con la espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), microscopía electrónica de transmisión (TEM), y un protón (1 H) de resonancia magnética nuclear (RMN). MPC películas se montan sobre SAM interfaces de electrodos modificados de oro mediante el uso de un "ciclo de salsa" método de alternar capas de MPC y ditiol moléculas de enlace. Crecimiento de la película en el electrodo de oro se hace un seguimiento electroquímicamente mediante la medición de cambios en la doble capa de carga actual del sistema. Películas análogos montados en portaobjetos de vidrio de silano modificado permita el seguimiento óptico de crecimiento de la película y un análisis transversal TEM proporciona un espesor estimado. Durante el montaje de cine, la manipulación de la protección ligando MPC, así como el mecanismo de vinculación entre partículas permiten películas en red, que son fácilmente adaptables, para interactuar con proteínas redox que tienen diferentes mecanismos de adsorción. Por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa azurina (AZ) pueden ser adsorbidos hidrofóbicamente a ditiol vinculados a las películas de los PSM hexanethiolate y citocromo c (cyt c) se puede inmovilizar electrostáticamente en un ácido carboxílico modificado MPC capa interfacial. En este informe, nos centramos en el protocolo de la película para que el sistema AZ exclusivamente. Investigaciones que involucran a la adsorción de proteínas en las plataformas MPC sintética modificada podría facilitar la comprensión de las interacciones entre biomoléculas y materiales hechos por el hombre, y por lo tanto ayudar al desarrollo de planes de biosensores, sistemas de modelado de ET, y materiales sintéticos biocompatibles. 5-8
Protocol
1. Hexanethiolate monocapa Síntesis Protegidas racimos de oro
Hexanethiolate monocapa funcionalizada protegidos racimos de oro (PSM) se sintetizan después de un 2:01 1 hexanethiol (C6) de relación en moles de oro para producir una estructura promedio de Au 225 (C6) 75. 4-9 Las modificaciones específicas a la reacción Brust, como tratamientos de tipo ligando específico ratios tiol a oro, la temperatura y el caudal de reacción, o la síntesis de mensaje-, 9-11 puede producir una amplia gama de tamaños de los países socios mediterráneos con el núcleo diferentes grupos funcionales y de protección, respectivamente. 4 El aproximada MPC ( promedio) las composiciones de los PSM funcionalizados con diferentes grupos alcanotiol puede ser determinada por protones (1 H) de resonancia magnética nuclear (RMN) el análisis de muestras de yodo descompuesto.
- Disolver 1,1 g de bromuro de tetraoctilamonio (TOABr) en 30 ml de tolueno con una ventilación adecuada campana de humos.
- Disolver 0,38 g de borohidruro de sodio (NaBH 4) en ~ 20 ml de agua 18 mW ultrapurificado (UP H 2 O) y se deja enfriar en hielo durante al menos 30 min.
- Disolver 0,31 g de hidrógeno tetracloroaurato (HAuCl 4) en aproximadamente 20 ml de UP H 2 O y transferir cuantitativamente la mezcla de solución a la solución TOABr-tolueno con un adicional de ~ 5 ml de H 2 O UP con el fin de transferencia de fase acuosa del oro solución a la solución acuosa. Revuelva suavemente con rigor, mientras que un tope de 30 minutos para que el quemado fases acuosas y no acuosas de color naranja claro se mezcla bien.
- Transferencia tanto de la acuosa clara y quemado fases acuosas de naranja a un embudo de separación. Descartar la fase acuosa (inferior) de la capa y se decanta el no acuosa (superior) de la capa en un frasco limpio.
- Añadir C6 en una proporción de 2:1 con HAuCl 4 a la solución acuosa. Agitar durante 30 minutos para formar una Au (I) de polímero, como se detecta por un cambio de color de naranja rojizo a una solución de color amarillo pálido, casi incoloro.
- Transferencia de la mezcla de reacción a un baño de hielo y el frío aislado a 0 ° C durante al menos 30 minutos con agitación.
- Cuantitativamente y añadir rápidamente el frío NaBH4 solución a la mezcla de reacción a fin de reducir Au (I) a un oro metálico en presencia de tioles, instantáneamente formando una solución espesa y negro de los países socios mediterráneos con la adición. Revuelva la reacción durante la noche a 0 ° C.
- Transferencia de la mezcla de reacción a un embudo de separación, deseche la solución acuosa (inferior) de la capa en un vaso de residuos, y evaporar el rotativo no acuosa (superior) la capa de tolueno a sequedad casi total dejando un lodo negro y grueso en el matraz.
- Precipitar el PSM mediante la adición de acetonitrilo y que permite sentarse durante la noche.
- Recoger los PSM por filtración al vacío con una frita de vidrio de porosidad media con accesorios de goma y secundarios armados matraz con aspirador y enjuagar con una copiosa cantidad de acetonitrilo.
- Permita que los países socios mediterráneos se seque al aire, pese producto, se caracterizan por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el análisis de RMN, y almacenar un tope para su uso futuro. Obtener imágenes de TEM de los PSM de fundición de abandono en tolueno en formvar / película de carbón de apoyo en la red de cobre (400 mesh) y el funcionamiento del instrumento TEM a 80-100 kV. El tamaño del núcleo promedio puede estimarse utilizando el software de análisis de imagen como la imagen J (freeware).
2. Vídeo de montaje: ditiol vinculados a la Asamblea de Cine de MPC para Electroquímica de proteínas monocapa
El sustrato de oro es la primera electroquímicamente limpiar y modificados con un SAM C6 antes de la inmersión en la alternancia de las soluciones de moléculas de enlace y ditiol PSM C6 modificado para hacer un "ciclo de salsa", que se repite varias veces que finalmente forman una asamblea ditiol vinculados MPC película . Como se ha descrito en estudios anteriores, 2 el plásmido original de la Pseudomonas aeruginosa azurina (AZ) proteína fue dado amablemente por el Dr. Corey Wilson de la Universidad de Rice y AZ se presenta como un polvo liofilizado y purificado por el profesor de la Universidad de Richmond, el Dr. Jonathan Dattelbaum, que fue posteriormente rehidratados con 4.4 mM de tampón fosfato de potasio (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mm) para crear una solución 5.10 M como mediante el análisis ultravioleta visible (UV-Vis).
- Monte el sensor electroquímico (Echem) sándwich de células en el siguiente orden de abajo hacia arriba: la primera placa de retención Lucite, sustrato de oro como un electrodo de trabajo, póngase en contacto con latón eléctrica al electrodo de trabajo de oro, primera junta de goma, Viton o-anillo que define el área de los electrodos (0,32 cm 2), cuerpo de vidrio celular, junta de goma en segundo lugar, y la segunda placa de retención Lucite. Toda la célula se mantiene unida por varillas roscadas y cuidadosamente apretar las tuercas de mariposa. La celda está equipada con un electrodo de referencia comercialmente adquirida que cuenta con un cilindro de vidrio con 1 M KCl saturado, Ag / AgCl de alambre de referencia, y un hilo de Pt electrodo auxiliar.
- Electroquímicamente ª limpiezae sustrato de oro mediante la realización de voltametría cíclica (CV) en las ventanas de potencial 0,2 a 0,9 V, 0,2 a 1,2 V, y de 0,2 a 1,35 V (frente a Ag / AgCl, KCl) a 100 mV / s en una solución de 0,1 MH 2 SO 4 y 0,01 M KCl.
- Medir la corriente de carga del sustrato de oro limpiar desnuda realizando CV en "condiciones normales", incluyendo una ventana potencial de 0,1 a 0,4 V (frente a Ag / AgCl, KCl) escaneadas a 100 mV / s en KPB. KPB Eliminar 1 y enjuague sucesivamente con UP H 2 O, el etanol (EtOH), UP H 2 O, y EtOH.
- Exponer el sustrato de oro para limpiar alrededor de 300 l de solución 5 mM C6 en EtOH y dejar reposar toda la noche para formar un orden SAM C6. Desechar la solución de la celda C6 y enjuague sucesivamente con EtOH, UP H 2 O, EtOH, y UP H 2 O.
- Medir la corriente de carga de la SAM en condiciones normales. Deseche KPB y enjuague sucesivamente con UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, y EtOH. La corriente de carga debe ser marcada disminución de la de la medición de oro desnudo (paso 2.3) 1.
- Exponer el sustrato SAM modificado de oro a alrededor de 300 l de 5 mM 1,9-nonanedithiol (END) en la solución de EtOH y deje reposar durante 1 hora a interdisperse END que une las moléculas dentro de la SAM C6. Desechar la solución de END y enjuague a fondo con forma sucesiva y EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, y cloruro de metileno (CH 2 Cl 2).
- Exponer el sustrato de oro a una solución MPC de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) con agitación lentamente burbujeante, con gas N 2 durante 1 hora. Si es necesario, sustituya evaporada solución MPC con más CH 2 Cl 2. Esta es la capa de anclaje MPC de la asamblea de cine. Desechar la solución MPC y otra vez aclarado sucesivamente con CH 2 Cl 2, hasta H 2 O, y KPB.
- Medir la corriente de carga de la capa de MPC en condiciones normales. Deseche KPB y enjuague sucesivamente con UP H 2 O y CH 2 Cl 2.
- Exponer el sustrato de oro a alrededor de 300 l de solución 5 mM NDT de CH 2 Cl 2 con agitación lentamente burbujeante, con gas N 2 durante 20 minutos.
- Deseche NDT y enjuagar bien con CH 2 Cl 2. Repita los pasos 2.7 y 2.8 para depositar la segunda capa de MPC de la asamblea de cine.
- Para depositar capas adicionales MPC, los pasos 2.9 y 2.10 se repiten. Con cada capa adicional de MPC correspondiente aumento en la corriente de carga que se observa.
- Después de la película en red MPC es completa, enjuague el sustrato de película modificado con KPB. AZ proteína es absorbido en el conjunto de la película MPC mediante la inyección de ~ 150 ~ l de solución de 5.10 M a la Z de KPB en la célula sándwich Echem y permitir que se siente tapado y refrigerado por lo menos 1 hora.
- Retire la celda Echem de la nevera y deje que vuelva a la temperatura ambiente cerca. Lave con abundante KPB, recarga celular Echem con KPB y KPB burbuja con gas N 2 durante 10 minutos.
- Proteína monocapa estudios electroquímicos se realizan como CV en la ventana de potencial de -0,25 V a 0,25 V (frente a Ag / AgCl, KCl) escaneadas a 100 mV / s en KPB.
3. Vídeo de montaje: ditiol vinculados a la Asamblea de Cine de MPC para el seguimiento óptico
Antes de hacer crecer las capas MPC para la evaluación óptica, las secciones de diapositivas de vidrio son pre-limpiado con una solución Piranha (ATENCIÓN: 02:01 concentrado H 2 SO 4 y H 2 O 2) y tratados con (3-mercaptopropyl)-trimetoxisilano (3-MPTMS ). 1-2 películas MPC se ensamblan en estas vidrio modificado las diapositivas mediante la "caída del ciclo" técnica como se ha descrito anteriormente.
- Enjuague un 3 MPTMS diapositivas de vidrio modificado con CH 2 Cl 2 y colóquela en una solución MPC de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) durante 1 hora mientras se agita en un agitador a baja velocidad. Esto completa la primera capa de MPC de la asamblea de cine mediante el anclaje de los PSM a la endgroups mercaptanos del silano. Enjuague el portaobjetos completamente con CH 2 Cl 2, y secar con N 2 gas. Toma un espectro UV-Vis (de 400 a 1000 nm) de la diapositiva, y aclarar de nuevo con CH 2 Cl 2.
- Colocar la placa en una solución de NDT 5 mM de CH 2 Cl 2 durante 1 hora mientras se agita en un agitador a baja velocidad. Lave la lámina con CH 2 Cl 2.
- Colocar la placa en una solución MPC durante 1 hora mientras se agita en un agitador a baja velocidad. Con esto se completa la segunda capa de MPC de la asamblea de cine. Enjuague el portaobjetos completamente con CH 2 Cl 2, N 2 seco con gas, y tener un espectro UV-Vis (de 400 a 1000 nm) de la diapositiva. La absorción en el espectro debe aumentar a medida que las capas adicionales de MPC se adsorben a la asamblea de cine.
- Para depositar capas adicionales MPC, steps 3.2-3.3 se repiten.
4. Caracterización de una sola capa de oro protegidas Asambleas de Cine de Cluster de la Cruz Seccional Microscopía Electrónica de Transmisión
TEM secciones son preparados por las películas de re-incorporación de la cara es incorporado. 2, 12 Esto se hace por primera fijación de una película MPC montado en un portaobjetos de vidrio de 3 MPTMS modificado en un microscopio limpio, estándar Insertar diapositivas con 812 resina epoxi para permitir la mejora de la manipulación durante el procedimiento siguiente. Tenga cuidado con la aplicación de calor como las altas temperaturas se descomponen los países socios mediterráneos dentro de la película.
- Incorporar la mezcla de resina epoxi 812 y dejar espesar durante al menos 12 horas.
- Llenar un "00" cápsulas BEEM con resina epoxi y se invierte en la parte superior de la muestra de cine MPC (preparado en la sección 3). Ejercer presión sobre la cápsula, para que una burbuja se eleva a la parte superior de la cápsula, la creación de un sello entre la resina epoxi y una muestra de cine MPC. Dejar polimerizar durante al menos 18 horas a 60 ° C y luego enfriar las diapositivas montadas a temperatura ambiente.
- Calor diapositivas montadas de 20 segundos en una placa de aluminio fundido caliente a 200 ° C con el fin de facilitar la extracción del bloque con la película de cara adjunta en MPC.
- Cortar la muestra que contiene la película fuera del bloque de cápsula BEEM vio con un joyero.
- Vuelva a insertar la porción eliminada en un molde de silicona plana con el lado de la película MPC de cara al interior del silicio también. Rellene el silicio y con resina epoxi a temperatura ambiente y dejar polimerizar durante al menos 18 horas a 60 ° C. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente.
- Obtener secciones delgadas de muestras de 60-80 nm en un ultramicrotomo Leica UCT mediante el uso de una cuchilla de diamante para cortar secciones perpendiculares al filo de la navaja.
- Coloque rebanadas secciones sobre formvar / película de carbón de apoyo en la red de cobre (400 mesh) y tomar imágenes de TEM de preparar secciones transversales de las asambleas de cine MPC.
5. Los resultados representativos:
Figura 1 capa doble de carga de supervisión actual de crecimiento de la película MPC para un total de 5 ciclos de inmersión (alternando la exposición a la MPC y soluciones NDT). Corriente de carga aumentó de forma sistemática con cada ciclo de inmersión, y agregó que "capas" de MPC a la película (Fig. 2). El voltamogramas cíclicos fueron recolectados a través de una ventana potencial de 0,1 a 0,4 V (frente a Ag / AgCl, KCl) escaneadas a 100 mV / s en 4,4 mM de tampón fosfato de potasio (pH = 7,0, μ = 10 mm). Reproducido con permiso del ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marcas CB, Lawrence NT, Trawick ML, y Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 2 (a) Representación esquemática de la proteína AZ adsorbido a una asamblea película ditiol vinculados a MPC. (B) Voltamograma cíclico típico de AZ adsorbidos en la película de montaje MPC recolectados a través de una ventana potencial de -0,25 a 0,25 V (frente a Ag / AgCl, KCl) escaneadas a 100 mV / s en 4,4 mM de tampón fosfato de potasio (pH = 7,0, μ = 10 mm).
Figura 3 Representante UV-Vis de monitoreo del espectro de un crecimiento de la película ditiol vinculados a MPC en un portaobjetos de vidrio de 3 MPTMS modificado. Un ciclo de baño consta de una exposición de la lámina de vidrio de NDT solución enlazador seguido de una exposición a la solución de MPC. Los resultados de cada inmersión posterior en el crecimiento en el espesor de la película y un aumento de la absorbancia concurrentes. Como el número de ciclos de inmersión aumenta, la banda de plasmones de superficie se van definiendo a ~ 520 nm. Reproducido con permiso del ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marcas CB, Lawrence NT, Trawick ML, y Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 4 microscopía electrónica de transmisión (TEM) de análisis de imágenes seccionales cruzadas de un montaje de la película ditiol vinculados a MPC. Recuadro: la imagen típica de TEM hexanethiolate PSM funcionalizados utilizados en el montaje de cine. Análisis de TEM determinó un diámetro núcleo de oro promedio de los países socios mediterráneos que se ~ 2 nm utilizando el análisis de la imagen J. Reproducido con permiso del ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marcas CB, Lawrence NT, Trawick ML, y Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
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Discussion
Electroquímica de proteínas monocapa es una técnica efectiva para estudiar las interacciones entre las proteínas redox y sintéticos plataformas de adsorción. La eficacia de esta estrategia, sin embargo, depende de la habilidad para diseñar una interfaz de adsorción con un alto grado de control de nivel molecular. Las plataformas basadas en MPC creado por este protocolo representa plataformas específicamente diseñadas que son capaces de proporcionar una proteína más homogénea medio ambiente y facilitar la absorción 3 ET a una distancia mayor 2 en comparación con los sistemas tradicionales que emplean PME SAM alkanethiolate. Un punto fuerte de la asamblea de cine MPC como una interfaz electroquímica es su versatilidad y adaptabilidad a otras proteínas redox de diferente tamaño y superficie de la química / función, varios nanomateriales diferentes, y otras configuraciones de electrodos también. Por ejemplo, el procedimiento descrito se adapta fácilmente a los estudios de ET del citocromo c (cyt c) mediante el uso de simples intercambios lugar las reacciones en la capa más externa de los países socios mediterráneos incorporados al conjunto. 11 Como cyt c es catiónico y es capaz de unirse a los sustratos electrostáticamente, carboxílicos terminado ácido-tioles alcanotioles se puede colocar a intercambiar en los ligandos periférica de los países socios mediterráneos que incluye la interfase electrodo modificado para facilitar la inmovilización electrostática conducido de la proteína, con el consiguiente análisis electroquímico es idéntica a la descrita aquí. 1 Para ajustar el tamaño de los países socios mediterráneos para dar cabida a diferentes tamaños de las proteínas, los ajustes a la síntesis Brust, como el cambio de tiol a ratios de oro, la reacción de la temperatura / velocidad de suministro, el rendimiento de una amplia gama de diámetros de MPC que coincida con el diámetro aproximado de una proteína específica . 9-10
El procedimiento general, los ciclos repetitivos principalmente de la exposición a las partículas y las moléculas de enlace (capa por capa), ha sido utilizado con éxito para crear películas delgadas de la incorporación de una variedad de nanomateriales diferente. Por ejemplo, las nanopartículas acuosa (PN) con diferentes recubrimientos protectores y sus propiedades ópticas se han conectado en las películas que están relacionadas exclusivamente con las interacciones electrostáticas entre PN y puentes polielectrolito. 13 La misma estrategia se ha aplicado también a la construcción de película de alta sensibilidad óptica asambleas con nano shell o PN hueco.
Mientras que el procedimiento descrito aquí utiliza diseñado celdas electroquímicas y los sustratos de oro, que es fácilmente adaptable a los electrodos más genérico, configuraciones de electroquímica, y las técnicas electroanalíticas. Además de todas las películas se describe la posibilidad de ser construidos sobre electrodos de oro evaporado y las diapositivas de cristal, las películas también han sido montados fácilmente en común electrodos de oro de disco que están disponibles a partir de instrumentos o sistemas de CH Bioanalytical (BAS). A pesar de voltametría cíclica sigue siendo la principal técnica electroquímica en la PME, recientemente hemos analizado con éxito monocapa de proteínas ET con una variedad de técnicas electroquímicas, incluyendo el paso, el pulso, y la impedancia de técnicas basadas en 14.
Investigación y desarrollo de nanomateriales basados en interfaces para la adsorción de proteínas están en curso, pero las asambleas de cine MPC se describe en este informe representan una estrategia eficaz y mejor para los estudios de la PME. El procedimiento es relativamente sencillo y se puede realizar por los estudiantes y científicos de todos los niveles, la creación de películas de gran versatilidad que puede ser fácilmente adaptada a los objetivos específicos de proteínas si es necesario.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Queremos agradecer a la Fundación Nacional de Ciencias (CHE-0847145), y el profesor Henry Dreyfus-Académico del Programa de Premios por su generoso apoyo a esta investigación. Nos gustaría reconocer específicamente Christine Davis, Director de Microscopía e Imagen en el Departamento de Biología de la Universidad de Richmond por su ayuda en la sección transversal de imágenes. Un agradecimiento especial se da a los Dres. T. Leopold, la sentencia de R. Kanter, Kellogg D., R. Miller, y W., así como, Russ Collins, Joseph Fil, Marcas de Carolyn, Mallory y Mandy Wimbush John - todos los cuales hacen posible la investigación de pregrado en la Universidad de Richmond. Un personal muy agradecimiento es para todos los investigadores actuales, cursos pasados y futuros en el Laboratorio de Investigación de Leopold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraoctylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 294136 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Hydrogen tetrachloroaurate | Sigma-Aldrich | 254169-5G | |
| 1-Hexanethiol | Sigma-Aldrich | 234192 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | 1010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | Bruker Corporation | 300 MHz | |
| Formvar/carbon support film on copper grid (400 mesh) | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | |
| Gold substrate | Evaporated Metal Films Corp. | Custom | |
| Ag/AgCl Reference electrode | Microelectrodes, Inc. | MI-401F | |
| Potentiostats | CH Instruments, Inc. | CHI650A, CHI610B | |
| 1,9-Nonanedithiol | Sigma-Aldrich | N29805 | |
| (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Agilent Technologies | 8453 | |
| Embed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| "00" BEEM capsule | Electron Microscopy Sciences | 70000-B | |
| Silicon flat mold | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Diamond knife | Diatome | 21-ULE, S12801 |
References
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