Summary
Colloïdes d'or stabilisées Alkanethiolate connus comme des grappes monocouche protégée (PPM) sont synthétisés, caractérisés, et assemblés en couches minces comme une interface d'adsorption pour l'électrochimie monocouche de protéines de protéines redox simples comme
Abstract
Nanoparticules d'or colloïdal protégée avec des ligands alkanethiolate appelés clusters monocouche d'or protégées (PPM) sont synthétisés et ensuite incorporées dans les assemblées du film qui servent de plates-formes d'adsorption pour l'électrochimie monocouche de protéines (PME). PME est utilisé comme système modèle pour l'étude des propriétés électrochimiques des protéines redox en les confinant à une plateforme d'adsorption à une électrode modifiée, qui sert également comme un partenaire redox pour le transfert d'électrons (HE) des réactions. Des études ont montré que l'or assemblées film de nanoparticules de cette nature à assurer un environnement plus homogène adsorption des protéines et de promouvoir HE sans dépendance à distance par rapport aux systèmes plus traditionnels modifiés avec alcanethiol monocouches auto-assemblées (SAM). 1-3 Dans ce papier, PPM fonctionnalisés par des ligands hexanethiolate sont synthétisés en utilisant une réaction Brust modifiés 4 et caractérisés par spectroscopie visible (UV-Vis) ultraviolette, microscopie électronique à transmission (MET), et le proton (1 H) par résonance magnétique nucléaire (RMN). MPC films sont assemblés sur des interfaces modifiées SAM électrode en or en utilisant un «cycle de baisse" méthode des couches alternées MPC et dithiol molécules de liaison. La croissance du film à l'électrode d'or est suivi électrochimique en mesurant les changements de la double couche de courant de charge du système. Films analogues montés sur lames de verre modifiés silane permettre un suivi optique de croissance du film et de l'analyse TEM transversale fournit une épaisseur du film estimé. Lors du montage du film, la manipulation de la protection de ligand MPC ainsi que le mécanisme de liaison entre particules permettent de films en réseau, qui sont facilement adaptables, pour s'interfacer avec des protéines redox ayant différents mécanismes d'adsorption. Par exemple, Pseudomonas aeruginosa azurine (AZ) peut être adsorbé hydrophobiquement au dithiol liés films de PPM hexanethiolate et cytochrome c (cyt c) peuvent être immobilisés électrostatiquement à un acide carboxylique modifiés MPC couche interfaciale. Dans ce rapport, nous nous concentrons sur le protocole de films pour le système de AZ exclusivement. Enquêtes impliquant l'adsorption des protéines sur des plates-formes modifiées MPC synthétique pourrait approfondir la compréhension des interactions entre biomolécules et matériaux synthétiques, et par conséquent l'aide au développement des régimes de biocapteur, la modélisation des systèmes HE, et les matériaux synthétiques biocompatibles. 5-8
Protocol
1. Hexanethiolate monocouche protégées Synthèse d'or clusters
Hexanethiolate fonctionnalisés grappes monocouche d'or protégées (PPM) sont synthétisés après une 1-02h01 hexanethiol (C6) au rapport molaire d'or pour produire une structure moyenne de Au 225 (C6) 75. 4-9 modifications spécifiques à la réaction Brust, comme traitements de type ligand, spécifique thiol-à-or des ratios, la température et le taux de livraison de réaction, ou post-synthèse, 9-11 peut produire une gamme diversifiée de PPM avec des tailles différentes et fonctionnelles fondamentales des groupes protecteurs, respectivement. 4 Le approximative MPC ( moyenne) des compositions du PPM fonctionnalisés avec divers groupes alcanethiol peut être déterminé par proton (1 H) par résonance magnétique nucléaire (RMN) l'analyse des échantillons d'iode-décomposés.
- Dissoudre 1,1 g de bromure de tétraoctylammonium (TOABr) dans 30 ml de toluène avec une ventilation appropriée capuche fumées.
- Dissoudre 0,38 g de borohydrure de sodium (NaBH 4) dans ~ 20 ml d'eau de 18 MQ ultrapurifiée (UP H 2 O) et laisser refroidir sur glace pendant au moins 30 min.
- Dissoudre 0,31 g d'hydrogène tétrachloroaurate (HAuCl 4) dans ~ 20 mL de H 2 O UP et transvaser quantitativement le mélange de solution à la solution TOABr-toluène en utilisant un supplément de ~ 5 mL de H 2 O UP afin de transfert de phase aqueuse de l'or solution à la solution non aqueuse. Remuer avec rigueur tout en sollicitant légèrement plafonné pendant 30 min afin de l'orange brûlé aqueux et non aqueux sont claires phases en mélangeant bien.
- Transfert à la fois la phase aqueuse claire et orange brûlé phases non aqueux à une ampoule à décanter. Jeter la solution aqueuse (en bas) et décanter la couche de non-aqueux (en haut) la couche dans un flacon propre.
- Ajouter C6 dans un rapport de 2:1 avec HAuCl 4 à la solution non aqueux. Remuez pendant 30 min pour former une Au (I) polymère, tel que détecté par un changement de couleur de l'orange rougeâtre à jaune pâle, solution presque incolore.
- Transférer le mélange réactionnel à un bain de glace isolés et refroidir à 0 ° C pendant au moins 30 min en remuant.
- Quantitativement et ajouter rapidement l'réfrigérée solution de NaBH4 au mélange réactionnel afin de réduire Au (I) pour une médaille d'or métallique en présence de thiols, instantanément, formant une solution noire épaisse du PPM lors de l'addition. Incorporer une nuit de réaction à 0 ° C.
- Transférer le mélange réactionnel dans une ampoule à décanter, éliminer la phase aqueuse (en bas) la couche dans un bécher de déchets, et rotatifs évaporer les non aqueux (en haut) couche de toluène à la sécheresse complète proximité laissant une boue noire épaisse dans le ballon.
- Précipiter les PPM en ajoutant l'acétonitrile et permettant de s'asseoir pendant la nuit.
- Recueillir des PPM par filtration sous vide en utilisant une fritte de verre de porosité moyenne avec des raccords en caoutchouc et secondaires armés flacon avec aspirateur et rincer avec une grande quantité d'acétonitrile.
- Laisser sécher à l'air PPM, peser produit, caractériser par microscopie électronique en transmission (TEM) et analyse par RMN, et stocker plafonnés pour une utilisation future. Obtenir des images TEM à goutte-casting PPM dissous dans le toluène sur formvar / film de support de carbone sur grille de cuivre (400 mesh) et de fonctionnement de l'instrument TEM à 80-100 kV. La taille moyenne de coeur peut être estimée en utilisant le logiciel d'analyse d'images telles que Image J (freeware).
2. Film Assemblée: dithiol liés Assemblée film MPC pour l'électrochimie monocouche de protéines
Le substrat d'or est d'abord nettoyé et électrochimique modifié avec un SAM C6 avant de l'immerger en alternant les solutions de molécules de liaison et de dithiol PPM C6 modifié pour le rendre un «cycle de baisse», ce qui est répété plusieurs fois pour finalement former un assemblage de films liés dithiol-MPC . Comme décrit dans les études antérieures, 2 plasmide d'origine pour le Pseudomonas aeruginosa azurine (AZ) protéine a été gracieusement donné par le Dr. Corey Wilson de l'Université Rice et AZ a été fournie sous forme de poudre lyophilisée purifiée et par l'Université de Richmond professeur, le Dr Jonathan Dattelbaum, qui a ensuite été réhydraté avec 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mm) pour créer une solution uM 50-10 tel que vérifié par l'analyse visible (UV-Vis) ultraviolets.
- Assemblez la cellule électrochimique sandwich (Echem) dans l'ordre suivant de haut en bas: d'abord la plaque de retenue Lucite, substrat d'or comme une électrode de travail, contactez cuivres électriques à l'électrode de travail en or, tout d'abord joint en caoutchouc, joint torique en Viton qui définit la zone d'électrode (0,32 cm 2), corps de la cellule de verre, joint en caoutchouc seconde, et la deuxième plaque de retenue Lucite. La cellule entière est maintenue par des tiges filetées et soigneusement serré les écrous à oreilles. La cellule est équipée d'une électrode de référence achetés dans le commerce qui abrite un cylindre en verre avec 1 M de KCl saturée, Ag / AgCl fils, et un fil de platine électrode auxiliaire.
- Électrochimiquement ème propressubstrat d'or e en effectuant voltamétrie cyclique (CV) dans les fenêtres potentielles de 0,2 à 0,9 V, 0,2 à 1,2 V, et de 0,2 à 1,35 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) à 100 mV / s dans une solution de 0,1 MH 2 SO 4 et 0,01 M de KCl.
- Mesurez le courant de charge du substrat d'or nue nettoyé en effectuant CV à "conditions standard", y compris une fenêtre de potentiel de 0,1 à 0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s dans KPB. Jeter une KPB et rincer successivement avec UP H 2 O, de l'éthanol (EtOH), UP H 2 O, et EtOH.
- Exposez le substrat d'or nettoyé à ~ 300 pi de solution à 5 mM dans EtOH C6 et laisser reposer toute la nuit pour former un commandés C6 SAM. Jeter la solution C6 de la cellule et rincez avec de l'EtOH successivement, UP H 2 O, EtOH, et UP H 2 O.
- Mesurer le courant de charge de la SAM dans des conditions standard. Jeter KPB et rincer successivement avec UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, et EtOH. Le courant de charge doit être nettement diminué, passant de celle de la mesure d'or nu (étape 2.3) 1.
- Exposer le substrat d'or SAM modifié pour ~ 300 pl de 5 mM 1,9-nonanedithiol (HAT) solution dans EtOH et laisser reposer pendant 1 heure pour interdisperse NDT reliant molécules au sein du SAM C6. Jeter la solution et rincer NDT successivement et de manière approfondie avec EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, et le chlorure de méthylène (CH 2 Cl 2).
- Exposez le substrat d'or à une solution PPM de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) avec agitation par lentement bouillonne de gaz N 2 pendant 1 heure. Si nécessaire, remplacez évaporé solution de PPM avec plus de CH 2 Cl 2. Il s'agit de la couche d'ancrage PPM de l'assemblage du film. Jeter la solution MPC et rincez à nouveau successivement avec CH 2 Cl 2, H 2 O UP, et KPB.
- Mesurer le courant de charge de la couche MPC dans des conditions standard. Jeter KPB et rincer successivement avec UP H 2 O et CH 2 Cl 2.
- Exposez le substrat d'or à ~ 300 pi de solution à 5 mM de NDT CH 2 Cl 2 avec agitation par lentement bouillonne de gaz N 2 pendant 20 min.
- Jeter NDT et rincez soigneusement avec du CH 2 Cl 2. Répétez les étapes 2,7 et 2,8 pour déposer la deuxième couche MPC de l'assemblage du film.
- Pour déposer des couches supplémentaires de MPC, les étapes 2,9 et 2,10 sont répétées. Avec chaque couche supplémentaire MPC une augmentation correspondante dans le courant de charge est observée.
- Après le film en réseau MPC est terminée, rincer le substrat de film modifié avec KPB. Protéines AZ est adsorbé sur le montage du film MPC en injectant ~ 150 pi de solution de ~ uM AZ 5-10 de KPB dans la cellule sandwich au Echem et permettant de s'asseoir plafonné et réfrigérés pendant au moins 1 heure.
- Retirez la cellule Echem du réfrigérateur et laissez revenir à température ambiante proche. Rincer abondamment à l'KPB, remplissez Echem cellule avec KPB, et la bulle KPB avec N 2 gazeux pendant 10 min.
- Protéines monocouche études électrochimiques sont effectuées comme CV dans la fenêtre de potentiel de -0,25 V à 0,25 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / sec dans KPB.
3. Film Assemblée: dithiol liés Assemblée film MPC pour repérage optique
Avant de croissance des films MPC pour l'évaluation optique, sections lame de verre sont pré-nettoyées avec une solution Piranha (Attention! 02:01 concentrée de H 2 SO 4 et H 2 O 2) et traitée avec (3-mercaptopropyle)-triméthoxysilane (3-MPTMS ). 1-2 films CPP sont ensuite assemblés sur ces diapositives de verre modifiés à l'aide du "cycle de baisse" technique que précédemment décrit ci-dessus.
- Rincer une lame de verre de 3 MPTMS modifié avec CH 2 Cl 2 et le placer dans une solution PPM de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) pendant 1 heure tout en agitant sur un agitateur à faible vitesse. Ceci termine la première couche MPC de l'assemblée du film par l'ancrage PPM les groupes terminaux mercaptans du silane. Rincer la lame soigneusement avec CH 2 Cl 2, et sécher avec un gaz N 2. Prenez un spectre UV-Vis (de 400 à 1000 nm) de la diapositive, puis rincer à nouveau avec CH 2 Cl 2.
- Placer la lame dans une solution HAT 5 mM de CH 2 Cl 2 pendant 1 heure tout en agitant sur un agitateur à faible vitesse. Rincer la lame avec du CH 2 Cl 2.
- Placer la lame dans une solution PPM pendant 1 heure tout en agitant sur un agitateur à faible vitesse. Ceci achève la deuxième couche MPC de l'assemblée du film. Rincer la lame soigneusement avec CH 2 Cl 2, sécher avec du gaz N 2, et de prendre un spectre UV-Vis (de 400 à 1000 nm) de la diapositive. L'absorbance dans le spectre devrait être plus que des couches supplémentaires de MPC sont adsorbés à l'assemblée du film.
- Pour déposer des couches supplémentaires de MPC, steps 3.2 à 3.3 sont répétées.
4. Caractérisation des monocouches protégées assemblées Or Cluster film par la Croix-microscopie électronique à transmission sectionnelles
TEM sections sont préparés par re-enrobage visage fr films embarqués. 2, 12 Cela se fait d'abord par la fixation d'un film MPC assemblés sur une lame de verre de 3 MPTMS modifiés sur un chiffon propre, microscope standard diapositives à l'aide de résine époxy Embed 812 pour permettre meilleure manipulation lors de la procédure ci-dessous. Soyez prudent avec la chaleur appliquée que des températures plus élevées se décomposent les PPM dans le film.
- Mélanger 812 Intégrer résine époxy et laisser épaissir pendant au moins 12 hr.
- Remplissez un "00" capsule de SEEB avec une résine époxy et inverser sur le dessus de l'échantillon de film MPC (préparé dans la section 3). Placez la pression sur la capsule afin que la bulle monte vers le haut de la capsule, la création d'un joint d'étanchéité entre la résine époxy et échantillon de film MPC. Laisser polymériser pendant au moins 18 h à 60 ° C, puis refroidir les diapositives montées à température ambiante.
- Chauffer diapositives pendant 20 sec sur une plaque en aluminium coulé à chaud à 200 ° C afin de faciliter le retrait du bloc avec un film MPC visage attachés fr.
- Couper l'échantillon contenant le film hors du bloc de la capsule à l'aide de SEEB scie de bijoutier.
- Re-embed la partie enlevée dans un moule en silicone à plat avec le côté film MPC jusqu'à tournée vers l'intérieur du silicium ainsi. Remplissez le silicium et de résine époxy à température ambiante et laisser polymériser pendant au moins 18 h à 60 ° C. Refroidir l'échantillon à température ambiante.
- Obtenir sections échantillon mince de 60-80 nm sur un Leica UCT ultramicrotome en utilisant un couteau de diamant pour couper des sections perpendiculaires à bord du couteau.
- Placez tranché sections sur formvar / film de support de carbone sur grille de cuivre (400 mesh) et de prendre des images TEM de préparer des coupes des assemblées du film MPC.
5. Les résultats représentatifs:
Figure 1 double couche de charge le suivi actuel de croissance du film MPC pour un total de 5 cycles de trempage (alternant exposition au MPC et des solutions NDT). Le courant de charge accrue systématiquement à chaque cycle trempage, ajoutant "couches" de MPC pour le film (Fig. 2). Les voltampérogrammes cycliques ont été recueillies en utilisant une fenêtre de potentiel de 0,1 à 0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s en 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (pH = 7,0, μ = 10 mm). Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figure 2 (a) Représentation schématique de la protéine Z adsorbées à un assemblage de films liés dithiol-MPC. (B) voltamogramme cyclique typique pour AZ adsorbés à MPC du film de montage recueillies en utilisant une fenêtre de potentiel de -0,25 à 0,25 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s en 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (pH = 7,0, μ = 10 mm).
La figure 3 représentant UV-Vis de surveillance spectrale d'une croissance liée dithiol films MPC sur une lame de verre de 3 MPTMS modifiés. Un cycle se compose d'un creux d'exposition de la lame de verre à NDT solution de linker suivie d'une exposition à la solution de PPM. Chaque résultat DIP ultérieurs de la croissance en épaisseur du film et une augmentation de l'absorbance concurrente. Comme le nombre de cycles augmente DIP, la bande de plasmon de surface est progressivement définie à ~ 520 nm. Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figure 4 microscopie électronique à transmission (MET) de la Croix d'analyse d'images en coupe d'un assemblage dithiol liés film de MPC. Encart: image MET typique de hexanethiolate PPM fonctionnalisés utilisés dans l'assemblage du film. Analyse MET déterminée d'un diamètre moyen de l'or cœur de la PPM à ~ 2 nm en utilisant une analyse Image J. Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
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Discussion
Électrochimie monocouche de protéines est une technique efficace utilisée pour étudier les interactions entre protéines redox et de synthèse des plates-formes d'adsorption. L'efficacité de cette stratégie, cependant, dépend de la capacité de construire une interface d'adsorption avec un degré élevé de contrôle au niveau moléculaire. Les plates-formes de MPC-base créé par ce protocole représentent les plates-formes spécialement conçues qui sont en mesure de fournir une protéine plus homogène l'environnement et de faciliter l'adsorption 3 HE sur une plus grande distance de 2 par rapport aux systèmes traditionnels PME employant SAM alkanethiolate. Une résistance de l'ensemble du film MPC comme une interface électrochimique est sa polyvalence et l'adaptabilité à d'autres protéines redox de taille différente et de chimie de surface / fonction, divers différents nanomatériaux, et les configurations d'électrodes de remplacement ainsi. Par exemple, la procédure décrite est facilement adapté à des études de HE de cytochrome c (cyt c) en utilisant de simples réactions d'échange lieu sur la couche extérieure des PPM intégrés dans l'assemblée. 11 Comme cyt c est cationique et est capable de se lier à des substrats électrostatique, des acides carboxyliques des thiols résilié alcanethiols peuvent être échangés contre des place-les ligands périphériques du PPM comprenant l'interface électrode modifiée afin de faciliter une immobilisation électrostatique conduit de la protéine, avec l'analyse subséquente électrochimique étant identique à celle décrite ici. 1 Pour régler le taille de la PPM pour accueillir différentes tailles des protéines, des ajustements à la synthèse Brust, comme le changement de thiol-à-or des ratios, la réaction de la température / débit, donnent une large gamme de diamètres MPC qui correspondront le diamètre approximatif d'une protéine cible . 9-10
La procédure générale, les cycles surtout répétitif de l'exposition aux particules et de molécules de liaison (couche par couche) a été utilisée avec succès pour créer des films minces incorporant une variété de différents nanomatériaux. Par exemple, les nanoparticules aqueuse (IP) avec différents revêtements protecteurs et des propriétés optiques uniques ont été mis en réseau dans des films qui sont liés exclusivement avec les interactions électrostatiques entre les IP et les ponts polyélectrolyte. 13 La même stratégie a aussi été appliquée à la construction du film hautement sensibles optiquement assemblées avec des nano shell ou IP creux.
Alors que la procédure décrite ici utilise personnalisées conçues cellules électrochimiques et des substrats d'or, il est facilement adaptable à d'électrodes plus générique, les configurations électrochimiques, et les techniques électroanalytique. En plus de tous les films décrits pouvant être construits sur des électrodes en or évaporé et lames de verre, les films ont également été facilement assemblés sur des électrodes communes disque d'or qui sont facilement disponibles auprès Instruments CH ou Bioanalytical Systems (BAS). Bien voltamétrie cyclique continue d'être la principale technique électrochimique dans PME, nous avons récemment analysé avec succès monocouche de protéines HE avec une variété de techniques électrochimiques d'autres, y compris les étapes, le pouls, et l'impédance des techniques basées. 14
Recherche et développement de nanomatériaux à base d'interfaces pour l'adsorption des protéines sont en cours mais les assemblées du film MPC décrite dans ce rapport représentent une stratégie efficace et améliorée pour les études de PME. La procédure est relativement simple et peut être réalisée par des étudiants et des scientifiques de tous niveaux, la création de films très polyvalent qui peut être facilement adapté à des cibles protéiques spécifiques si nécessaire.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions la National Science Foundation (CHE-0847145), et le professeur Henry Dreyfus Scholar-Programme de bourses pour les généreusement soutenir cette recherche. Nous tenons à reconnaître spécifiquement Christine Davis, directeur de la microscopie et d'imagerie dans le département de biologie de l'Université de Richmond pour son aide transversale d'imagerie. Un merci spécial est donnée à MM. T. Léopold, affaire R. Kanters, D. Kellogg, R. Miller, et W., ainsi que, Russ Collins, Phil Joseph, Carolyn Marks, Mandy et John Mallory Wimbush - qui tous font de la recherche de premier cycle à l'Université possibles de Richmond. Un merci très personnelle est donnée à tous les cours, passées et futures de chercheurs de premier cycle dans le laboratoire de recherche Léopold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraoctylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 294136 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Hydrogen tetrachloroaurate | Sigma-Aldrich | 254169-5G | |
| 1-Hexanethiol | Sigma-Aldrich | 234192 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | 1010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | Bruker Corporation | 300 MHz | |
| Formvar/carbon support film on copper grid (400 mesh) | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | |
| Gold substrate | Evaporated Metal Films Corp. | Custom | |
| Ag/AgCl Reference electrode | Microelectrodes, Inc. | MI-401F | |
| Potentiostats | CH Instruments, Inc. | CHI650A, CHI610B | |
| 1,9-Nonanedithiol | Sigma-Aldrich | N29805 | |
| (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Agilent Technologies | 8453 | |
| Embed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| "00" BEEM capsule | Electron Microscopy Sciences | 70000-B | |
| Silicon flat mold | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Diamond knife | Diatome | 21-ULE, S12801 |
References
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