Summary
単分子層保護のクラスタ（MPCは）として知られているAlkanethiolate安定化金コロイドは、合成の特徴、とのような単純な酸化還元蛋白質の蛋白質の単分子層の電気化学のための吸着インタフェースなどの薄膜に組み立てられる
Abstract
金コロイドは、タンパク質の単分子膜の電気化学（PME）の吸着のプラットフォームとして機能フィルムのアセンブリに合成され、その後に組み込まれている単分子膜保護金クラスター（MPCは）と呼ばれるalkanethiolate配位子で保護されたナノ粒子。 PMEは、電子伝達（ET）反応の酸化還元パートナーとして機能する修飾電極、少なくとも吸着プラットフォームにそれらを制限することで酸化還元タンパク質の電気化学的特性を研究するためのモデル系として利用されている。研究は、このような性質の金ナノ粒子膜のアセンブリは、より均質なタンパク質吸着の環境を提供し、アルカンチオール自己組織化単分子膜（SAM）で修飾された従来のシステムに比べて距離依存せずにETを促進することが示されている。本論文では1-3、のMPCをhexanethiolateリガンドで官能化されたが変更されたブラスト反応4を用いて合成し、紫外可視（UV - VIS）分光法、透過型電子顕微鏡（TEM）、およびプロトン（1 H）核磁気共鳴（NMR）で特徴付けられる。 MPCのフィルムは、MPCの層とジチオールリンク分子を交互の"ディップサイクル"メソッドを使用してSAM修飾金電極のインターフェイス上で組み立てられます。金電極での膜成長は、システムの充電電流二重層の変化を測定することにより電気化学的に追跡されます。シラン改質ガラススライド上に組み立てられた類似した膜は、膜成長及び断面TEM解析の光学的モニタリングを可能に推定膜厚が用意されています。フィルムのアセンブリの間に、MPCの配位子の保護だけでなく、粒子間のリンク機構の操作は、別の吸着機構を有する酸化還元蛋白質とのインタフェースに、容易に適応可能なネットワーク化されたフィルム、を可能にする。例えば、 緑膿菌アズリン（AZ）はhexanethiolate MPCとシトクロム c（CYT C）MPC界面層を変更したカルボン酸で静電的に固定化することができるのジチオール架橋フィルムに疎水性吸着させることができる。このレポートでは、我々は排他的にAZのシステムのためのフィルムのプロトコルに焦点を当てる。 MPC変更された合成プラットフォーム上のタンパク質の吸着を伴う調査では、生体分子と人工材料との相互作用の理解を深める、その結果、バイオセンサー方式、ETモデリングシステム、及び合成生体適合性材料の開発を支援することができます。5-8
Protocol
1。 Hexanethiolate単層保護された金クラスターの合成
Hexanethiolate官能性単分子膜保護金クラスター（MPCはは）のように、金225（C6）75の平均構造を生成するために金のモル比は2:1 1 -ヘキサンチオール（C6）。ブラスト反応〜4-9特定の変更に従って合成されています配位子の種類、特定のチオールから金の比率、温度、および反応の配信速度、または合成後の治療、9-11、それぞれ、さまざまなコアのサイズと機能的な保護基でのMPCの多様な範囲を得ることができる4。MPCの近似（様々なアルカンチオール基で官能化されたMPCはの平均）組成物は、プロトン（1 H）ヨウ素分解試料の核磁気共鳴（NMR）分析により決定することができます。
- 適切なヒュームフードの換気でトルエン30mLに1.1グラムのtetraoctylammoniumブロマイド（TOABrを）溶かす。
- 18MΩultrapurified水（H 2 O UP）の〜20mLに0.38グラムの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH 4の ） を溶解し、少なくとも30分間氷上で冷やしすることができます。
- UP H 2 Oの〜20mLに0.31グラムの水素テトラクロロ（HAuCl 4）溶解し、定量的なソリューションの混合物は、追加を使用してTOABr -トルエン溶液に移す〜UP、H 2 Oの5 mLを水、金に相転移するために、非水溶液への解決策。濃いオレンジ水溶液と明確な非水性相がよく混合されるように、軽く30分間蓋をしながら厳密にかき混ぜる。
- 分液漏斗に透明な水性と濃いオレンジ色水系相の両方を転送する。きれいなフラスコに非水系（上）層水（底部）層をデカントして捨てます。
- 非水溶液へHAuCl 4 2:1の割合でC6を追加。赤みがかったオレンジ色から淡黄色、ほぼ無色の溶液に色の変化によって検出されたとして、金（I）ポリマーを形成するために30分間かき混ぜる。
- 〜0℃で撹拌しながら、少なくとも30分間絶縁氷浴とチルに反応混合物を移す。
- 定量的かつ迅速に瞬時に添加時のMPCの太い黒色の溶液を形成し、チオールの存在下で金属の金へのAu（I）を軽減するために反応混合物に冷却したNaBH 4の溶液を添加する。 0℃で一晩反応をかき混ぜる
- 、分液ロートに反応混合物を譲渡する廃棄物のビーカーに水（底面）層を破棄し、フラスコ内の重い黒い汚泥を残してほぼ完全乾燥するまで非水系（上）トルエン層を蒸発させるロータリー。
- アセトニトリルを追加し、一晩座ってできるようにすることで、MPCのを沈殿させる。
- アスピレーターでゴム継手とサイドアームフラスコに培地多孔性のガラスフリットを使用して真空濾過によってのMPCを収集し、アセトニトリルのおびただしい量ですすいでください。
- 、空気乾燥へのMPCを許可する透過型電子顕微鏡（TEM）およびNMR分析により特徴づける、製品の重量を測定し、将来の使用のために頂いた店。ドロップキャスティングのMPCは銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上にトルエンに溶解し、80から100 kVでTEM装置を動作させることでTEM像を入手。平均コアサイズは、そのようなイメージJ（フリーウェア）などの画像解析ソフトウェアを使って推定することができます。
2。フィルムアセンブリ：タンパク質単分子層の電気化学のためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ
金基板は、最初の電気化学的に最終的にはジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリを形成するために数回繰り返される"ディップサイクルを、"補うためにジチオールリンク分子とC6変更のMPCのソリューションを交互に浸漬する前に洗浄し、C6 SAMで修飾されている。として緑膿菌アズリン（AZ）タンパク質が優雅にライス大学とアリゾナ州の博士コーリーウィルソンによって与えられたため、元のプラスミドはドクタージョナサン、リッチモンド教授の大学で精製し、凍結乾燥粉末として提供されていた2、先行研究で説明その後、紫外可視（UV - VIS）の分析によって検証として5〜10μmのソリューションを作成、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液（KPB、pHは= 7.0、μ= 10 mM）で再水和したDattelbaum、。
- 第一ルーサイトのリテーナプレート、作用電極、作用電極、金に真鍮の電気接点、電極面積を定義する最初のゴム製ガスケット、バイトンO -リングなどの金基板：下から上へ、次の順序で電気化学（EChemを）サンドイッチセルを組み立て（0.32 cm 2）を、ガラスの細胞体、第二ゴムのガスケット、もうルーサイトのリテーナープレート。セル全体がねじ山付きロッドによって一緒に保持し、慎重にウィングナットを締めている。セルは、1 M飽和KCl、Ag / AgCl参照線、および白金補助電極のワイヤーでガラスバレルを収納する、市販の参照電極が装備されています。
- 電気化学的にきれいな目100℃0.2〜0.9 V、0.2〜1.2 V、0.2〜1.35 Vの潜在的な窓でサイクリックボルタンメトリー（CV）を実行することにより電子の金基板（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）0.1の溶液中mVの/ sのMH 2 SO 4、0.01 M KClを。
- 0.1〜0.4 V（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンKPBでMV / sの1破棄KPBの電位窓を含む"標準的な条件、"でCVを行うことにより、洗浄裸の金基板の充電電流を測定し、すすぎ逐次UP H 2、H 2 O UP O、エタノール（EtOH）、、及びEtOHで。
- EtOH中5mMのC6のソリューションの〜300μlに洗浄金基板を公開し、注文したC6 SAMを形成するために一晩座ってすることができます。セルからC6の液を捨て、H 2 O UPエタノール、エタノール、およびUP H 2 Oで連続的に洗い流し
- 標準条件でのSAMの充電電流を測定します。 KPBを破棄し、H 2、H 2 O UP O、エタノール、およびエタノールUPで連続的に洗い流してください。充電電流は著しく裸の金の測定（ステップ2.3）のそれから減少させるべきである。1
- EtOH中5mMの1,9 - nonanedithiol（NDT）ソリューションの〜300μlにSAM修飾金基板を公開し、C6 SAM内の分子を結びつけるinterdisperse NDTに1時間放置することができます。 NDTの液を捨て、H 2 O UP H 2 O、エタノール、および塩化メチレン（CH 2 Cl 2）をアップ、EtOHで連続して、よくすすぐ。
- ゆっくりと1時間のためにN 2ガ スでバブリングすることにより攪拌しながらCHのMPC溶液を2 Cl 2中 （〜1 mg / mLの）に金基板を公開。必要に応じて、より多くのCH 2 Cl 2で蒸発MPCソリューションを交換してください。これはフィルムのアセンブリのアンカーMPCの層です。 MPCの液を捨て、再びCH 2 H 2 O UP Cl 2の 、、とKPBで連続してすすいでください。
- 標準条件でのMPCの層の充電電流を測定します。 KPBを破棄し、UP H 2 OとCH 2 Cl 2で連続してすすいでください。
- ゆっくりと20分間N 2ガ スでバブリングすることにより攪拌しながらCHの5mM NDTソリューション2 Cl 2中の〜300μlのために金基板を公開。
- NDTを破棄し、CH 2 Cl 2でよくすすぐ。フィルムのアセンブリの第2 MPCの層を堆積するステップ2.7および2.8を繰り返します。
- 追加のMPCの層を堆積させるために、手順2.9、2.10繰り返されます。各追加のMPCの層と充電電流の増加に対応が観察される。
- ネットワーク化されたMPCのフィルムが完了すると、KPBと基板改質膜をすすいでください。 AZのタンパク質は、EChemをサンドイッチセルにKPBの5〜10μMAZソリューションの〜150μLを注入し、蓋をし、少なくとも1時間冷蔵座ってできるようにすることで、MPCのフィルムのアセンブリに吸着される。
- 冷蔵庫からEChemをセルを削除し、それが室温近くに戻ることができます。徹底的に10分間N 2ガ スとKPB、KPBを補充EChemをセル、およびバブルKPBですすいでください。
- タンパク質単分子層の電気化学的研究が0.25 -0.25 Vから潜在的なウィンドウのCVとして実行されるV（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンしたMV / KPBの秒。
3。フィルムアセンブリ：オプティカルトラッキングのためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ
前の光学的評価のための成長MPCフィルム、スライドグラスのセクションピラニア溶液（注意2時01濃H 2 SO 4とH 2 O 2）であらかじめ洗浄とで処理している（3 -メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（3 - MPTMSへ）1-2 MPC膜は、その後、以前に上記のような"ディップサイクル"技術を使用して、これらの修正されたスライドガラス上に組み立てています。
- CH 2 Cl 2で3 MPTMS変更したスライドガラスをリンスし、低速でシェーカーで攪拌しながらCH 2のMPCソリューションCl 2の （〜1 mg / mL）は1時間に入れてください。これは、シランのメルカプタンの末端基にMPCはアンカリングによる膜アセンブリの最初のMPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2で完全にスライドをすすぎ、およびN 2ガ スで乾燥させます。スライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）取る、そしてCH 2 Cl 2で、再度洗い流す。
- 低速でシェーカーで攪拌しながら1時間CH 2 Cl 2中の5mM NDTソリューションでスライドを置きます。 CH 2 Cl 2でスライドを洗浄します。
- 低速でシェーカーで攪拌しながら1時間、MPCの溶液中でスライドを置きます。これはフィルムのアセンブリの第2 MPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2を 、N 2ガ スと乾燥で十分にスライドをすすぎ、およびスライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）を取る。追加のMPCの層がフィルムのアセンブリに吸着されるスペクトル全体吸光度は増加する必要があります。
- 追加のMPCの層を堆積させるために、STEPS 3.2から3.3までが繰り返されます。
4。単分子膜のキャラクタリゼーションは、断面透過型電子顕微鏡による金クラスターのフィルムアセンブリを保護
TEM断面が顔の埋め込 み膜EN RE -埋め込 むことによって調製される。2、12これは、最初にきれいな、標準的な顕微鏡の上に3 - MPTMS改質ガラススライド上に組み立てられたMPCのフィルムを取り付けることによって行われるために可能にするために埋め込 む812エポキシ樹脂を使用してスライド以下の手順の実行中に処理を改善。より高い温度は、フィルム内のMPCを分解するように適用される熱で、十分に注意してください。
- ミックスは812エポキシ樹脂を埋め込み、少なくとも12時間太くすることができます。
- エポキシ樹脂との"00"BEEMカプセルを記入し、MPCのフィルムのサンプル（セクション3で調製した）の上に反転させる。バブルは、カプセルの上部に上昇するようにカプセルの上に置いて圧力、エポキシ樹脂とMPCのフィルムのサンプルの間にシールを作成する。 60歳で少なくとも18時間重合することを許可° Cとし、室温にマウントされているスライドを冷却する。
- 熱は、接続されているMPC 専用の顔のフィルムでブロックの除去を容易にするために200℃アルミダイキャスト、ホットプレート上で20秒間スライドをマウント。
- 宝石商の鋸を使用してBEEMカプセルブロックからフィルムを含むサンプルをカット。
- よくシリコンの内部に直面してまでMPCフィルム側にシリコンフラット型で取り外した部分を再度埋め込む。室温でエポキシ樹脂と、シリコンを充填し60℃で少なくとも18時間重合することができます℃まで室温に試料を冷却する。
- ナイフのエッジに対して垂直にセクションをカットするダイヤモンドナイフを使用してライカUCTウルトラミクロトームを60から80 nmの薄いサンプルのセクションを取得します。
- 場所は銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上のセクションをスライスし、MPCのフィルムのアセンブリの準備断面のTEM像を取る。
5。代表的な結果：
5浸漬サイクル（MPC及びNDTソリューションへの露出を交互）の合計MPC膜成長の電流監視を充電1ダブルレイヤー図 。充電電流は、（図2）フィルムへのMPCの"レイヤー"を追加し、各浸漬サイクルを体系的に増加した。サイクリックボルタモグラムは0.1〜0.4、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液では100 mV / sの液（pH = 7.0、μ= 10 mm）でのスキャンV（対Ag / AgCl電極、KClを）電位窓を用いて収集した。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。
図2ジチオール架橋MPCのフィルムのアセンブリに吸着AZ蛋白質の（）模式図。 （b）のMPCフィルムアセンブリに吸着AZの典型的なサイクリックボルタモグラムは、Vが（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）4.4 mMのリン酸カリウム緩衝液（pH = 7.0では100 mV / sでスキャン-0.25から0.25への潜在的なウィンドウを使用して収集μ= 10 mM）を。
図3代表的な3 - MPTMS修正されたスライドガラス上にジチオール架橋MPC膜成長の紫外可視スペクトルのモニタリング。ディップのサイクルは、リンカのソリューションは、MPCのソリューションへの暴露を続けてNDTにスライドガラスの露出で構成されています。膜厚の成長と同時吸光度増加の後続の各ディップ結果。ディップサイクルの数が増えるにつれて、表面プラズモンのバンドは徐々に〜520nmで定義されています。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。
ジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリの図4透過電子顕微鏡（TEM）断面画像解析。挿入図：フィルムのアセンブリで使用されているhexanethiolate官能基のMPCの代表的なTEM像。 TEM分析は、画像Jの分析を用いて〜2 nmとするのMPCの平均金のコア径を決定する。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。
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Discussion
タンパク質の単分子層の電気化学は酸化還元蛋白質と合成吸着プラットフォーム間の相互作用を研究するために使用される有効な手法です。この戦略の有効性は、しかし、分子レベルの制御性の高い吸着インタフェースを設計する能力に依存しています。このプロトコルによって作成されたMPCベースのプラットフォームは、より均質なタンパク質吸着環境3を提供し、alkanethiolateのSAMを採用した従来のPMEのシステムに比べより大きな距離2を介してETを容易にすることができる特別に設計されたプラットフォームを表します。電気インタフェースとしてMPCのフィルムのアセンブリの強度だけでなく、異なるサイズや表面化学/機能、さまざまなナノ材料、および別の電極構成の他の酸化還元タンパク質にその汎用性と適応性です。例えば、説明する手順は、容易にアセンブリに組み込まMPCはの最も外側の層上に、単純な位置交換反応を用いてシトクロム c（CYT C）のET研究するように構成されている11 CYT cはカチオン性であり、基質に結合することができるように静電気的に、カルボン酸末端アルカンチオールのチオールは、その後の電気化学的分析はここで説明したものと同一であると、タンパク質の静電駆動型の固定化を容易にするために修飾電極のインタフェースを構成するのMPCの末梢リガンドに代わり、交換することができます1。調整するにはこのようなチオールから金の比率、反応温度/配信速度の変更など、タンパク質の様々なサイズ、ブラストの合成への調整を、収容するためのMPCの大きさ、標的タンパク質のおおよその直径に一致するMPCの直径の広い範囲を得る。。9-10
一般的な手順、粒子とリンク分子（レイヤーバイレイヤー）への曝露の主に反復サイクルが正常に異なるナノ材料の様々なを組み込んだ薄膜を作成するために使用されています。例えば、別の保護コーティングとユニークな光学特性を有する水性のナノ粒子（ナノ粒子）がナノ粒子と高分子電解質のブリッジ間の静電相互作用を排他的にリンクされているフィルムにネットワーク化されている。13同戦略はまた、非常に光学的に感応膜の建設に適用されていますナノシェルや中空ナノ粒子をフィーチャーしたアセンブリ。
ここで説明する手順は、カスタム設計された電気化学セルと金基板を使用するが、それはより一般的な電極、電気化学的構成、および電気分析技術に容易に適応可能である。金蒸着電極とスライドガラス上に構築することができるという説明したすべての作品に加えて、映画にも簡単にCHインスツルメンツまたはバイオアナリティカルシステムズ（BAS）から容易に利用できる共通のゴールドディスク電極上に組み立てられている。サイクリックボルタンメトリーは、PMEでの主要な電気化学的手法であり続けても、我々は最近、成功したタンパク質の単分子層を分析したETステップ、パルス、およびインピーダンスベースの技術を含む他の電気化学的手法、様々なています。14
タンパク質の吸着のためのナノ材料ベースのインタフェースの研究と開発が進行中であるが、このレポートで説明されているMPCのフィルムアセンブリは、PMEの研究のための効果的かつ改良された戦略を表しています。手順は比較的簡単であり、簡単に、必要に応じて特定のタンパク質のターゲットに合わせてカスタマイズできる汎用性の高いフィルムを作成し、学生やあらゆるレベルの科学者によって行うことができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は感謝して国立科学財団（CHE - 0847145）、と寛大にこの研究を支援するためのヘンリードレフュス教師学者賞プログラムを認めます。我々は、特にクリスティンデイビス、断面像と彼女の援助のためのリッチモンドの大学で生物学教室の顕微鏡とイメージングのディレクターを認識したいと思います。特別な感謝は、博士に与えられます。 T.レオポルド、R.カンテール、D.ケロッグ、R.ミラー、およびW.ケース、ならびに、ラスコリンズ、フィルジョセフ、キャロマークス、マンディマロリーとジョンWimbush - すべての大学で可能な学部生の研究を行うリッチモンドの。ありがとう非常に個人的にはレオポルドリサーチラボ内のすべての現在、過去、そして未来の学部の研究者に与えられます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraoctylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 294136 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Hydrogen tetrachloroaurate | Sigma-Aldrich | 254169-5G | |
| 1-Hexanethiol | Sigma-Aldrich | 234192 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | 1010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | Bruker Corporation | 300 MHz | |
| Formvar/carbon support film on copper grid (400 mesh) | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | |
| Gold substrate | Evaporated Metal Films Corp. | Custom | |
| Ag/AgCl Reference electrode | Microelectrodes, Inc. | MI-401F | |
| Potentiostats | CH Instruments, Inc. | CHI650A, CHI610B | |
| 1,9-Nonanedithiol | Sigma-Aldrich | N29805 | |
| (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Agilent Technologies | 8453 | |
| Embed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| "00" BEEM capsule | Electron Microscopy Sciences | 70000-B | |
| Silicon flat mold | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Diamond knife | Diatome | 21-ULE, S12801 |
References
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