Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo lavoro,<em> In vitro</em> Dosaggio dell'attività chinasica di LRRK2 e una selezione di suoi mutanti è descritto, fornendo un sistema sperimentale per esaminare la fosforilazione di substrati putativi e disfunzione potenziale di LRRK2 nella malattia.
Chinasi Ripetere leucina Rich 2 (LRRK2) è un aminoacido 2527 membro della famiglia ROCO di proteine, in possesso di una struttura complessa, multidominio tra cui un dominio GTPasi (chiamato ROC, per Ras di proteine complesse) e un dominio chinasi 1. La scoperta nel 2004 di mutazioni LRRK2 che causano la malattia di Parkinson (PD) ha portato ad LRRK2 essere al centro di un enorme volume di ricerca nella sua normale funzione e come la proteina va storto nello stato di malattia 2,3. Prime indagini nella funzione di LRRK2 concentrata sulla sua attività enzimatiche 4-6. Nonostante un quadro chiaro deve ancora emergere di una consistente alterazione di questi a causa di mutazioni, i dati di un certo numero di gruppi ha evidenziato l'importanza dell'attività della chinasi di LRRK2 nella morte cellulare legata a mutazioni 7,8. Recenti pubblicazioni hanno riportato inibitori intese a promuovere l'attività chinasica di LRRK2, fornendo uno strumento chiave sperimentale 9-11. Alla luce di questi dati,È probabile che le proprietà enzimatiche di LRRK2 ci offrono una finestra importante sulla biologia di questa proteina, anche se sono potenziali bersagli farmacologici per il Parkinson è aperta al dibattito.
Un certo numero di approcci diversi sono stati usati per il saggio di attività chinasica di LRRK2. Inizialmente, le analisi sono state effettuate utilizzando epitopo proteico tag sovra-espresso in linee cellulari di mammiferi e immunoprecipitato, con il test effettuato utilizzando questa proteina immobilizzato su perline agarosio 4,5,7. Successivamente, ricombinante purificata frammenti di LRRK2 in soluzione sono stati utilizzati anche, per esempio un frammento GST tag purificato da cellule di insetto contenenti residui 970-2527 di LRRK2 12. Recentemente, Daniels et al. Riferito l'isolamento di LRRK2 a figura intera in soluzione da cellule di rene embrionale, tuttavia questa proteina non è ampiamente disponibile 13. Al contrario, la fusione GST forma troncata di LRRK2 è commercialmente dispone (da Invitrogen, si veda la tabella 1 per i dettagli), e fornisce un comodo strumento per dimostrare un test per LRRK2 attività chinasi. Più uscite per LRRK2 attività chinasi sono stati segnalati. Autofosforilazione di LRRK2 stesso, la fosforilazione della proteina basica della mielina (MBP) come substrato generico chinasi e fosforilazione di un substrato artificiale – LRRKtide chiamato, sulla base fosforilazione della treonina 558 in Moesin – sono stati tutti utilizzati, così come una serie di putativi substrati fisiologici tra cui α-sinucleina, Moesin e 4-EBP 14-17. Lo stato di queste proteine come substrato per LRRK2 rimane poco chiaro, e come tale il protocollo descritto di seguito si concentrerà sull'utilizzo di MBP come substrato generico, sottolineando l'utilità di questo sistema di dosaggio LRRK2 attività chinasi diretto contro una vasta gamma di substrati potenziale.
Questo documento descrive un protocollo di base per saggiare l'attività chinasi di LRRK2 utilizzando un sistema in vitro. Per motivi di brevità, questo è stato limitato ad una durata di un'ora modello punto di arrivo utilizzando un substrato generico, ma il protocollo generale è applicabile a una vasta gamma di substrati potenziale e suscettibili di analisi più sofisticate esaminando la cinetica dell'attività chinasi di LRRK2 . Questo evidenzia uno dei vantaggi principali dell'utilizzo di un sistema in vitro per esaminare il comportamento di una proteina chinasi come questa: perché c'è il controllo completo sulle concentrazioni di enzima e substrato, è possibile generare dati cinetici e calcolare K m e V valori massimi per la reazione. Per le valutazioni cinetiche più dettagliate o per valutare l'impatto degli inibitori putativo, un sistema di throughput più elevato (come ad esempio quello offerto dalla utilizzando il substrato LRRKtide, disponibile da Invitrogen) è un superiore alternative per l'approccio descritto qui.
E 'importante, tuttavia, riconoscere che il sistema modello riduzionista fornite da test in vitro chinasi è solo uno strumento per esaminare la biologia di una chinasi e dei suoi rapporti con i substrati potenziale. I dati di test come questo deve essere usato in combinazione con altri approcci per ottenere un quadro completo di come si comporta una chinasi in vitro e in un contesto cellulare. Per esempio, un substrato putativo fosforilato in vitro possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per identificare phosphosites possibili che possono poi essere manipolati da mutagenesi mirata (ad es. Serina la conversione o la treonina residui accettore di fosfato a nessuno-phosphorylatable residui come l'alanina) per esaminare il funzionale conseguenze di fosforilazione ex vivo.
Una considerazione chiave per interpretare i dati da un sistema di analisi in vitro come questo sarebbe il rischio di either tipo I o tipo II (falsi positivi o falsi negativi) errori. La natura riduzionista di questo sistema dispone purtroppo di entrambi – nel caso della prima, avendo un substrato purificato putativo e purificata chinasi artificialmente nelle immediate vicinanze e ad alta concentrazione (rispetto al milieu cellulare) può causare eventi fosforilazione artefatti. Al contrario, molte chinasi funzionare come parte di un complesso all'interno del contesto della cellula, e richiedono co-fattori per la fosforilazione di un substrato dato che si verifichi. Come notato sopra, un risultato positivo da fosforilazione di un substrato putativo utilizzando un sistema di dosaggio in vitro dovrebbe poi essere testato in un sistema cellulare per convalidare il risultato, e un risultato negativo devono essere interpretati con cautela.
Alla luce di questo, è fondamentale dove è possibile avere controlli sia positivi che negativi per consentire uno studio comparativo delle attività della vostra chinasi di interesse. L'attenta selezione di un Contro positivol che ha un'attività conosciuta verso la vostra proteina di interesse, insieme a un controllo negativo che è improbabile che fosforilare il tuo substrato putativo, è estremamente prezioso. Un controllo candidato LRRK2 è Receptor interagire chinasi 3, che ha una sequenza strettamente legata primario al dominio della chinasi di LRRK2, ma ha una struttura molto diversa dominio totale 18. Questo è disponibile come proteina ricombinante da Invitrogen e viene utilizzato come controllo standard nel nostro laboratorio.
Va inoltre notato che la forma commercialmente disponibile di LRRK2 manca l'N-terminale della proteina ed è etichettato con il glutatione-s-transferasi, e questo dovrebbe essere preso in considerazione come potenziale fattore di confondimento nello svolgimento di test con questa proteina chinasi, come non si sa quale ruolo l'N-terminale di LRRK2 può giocare nella funzione normale di questa proteina. Se, per esempio, la porzione N-terminale di LRRK2, che è assente nella proteina utilizzata nel presente protocolloè fondamentale per l'assunzione di un substrato specifico per il dominio della chinasi di LRRK2 allora questo avrà un impatto importante sulla fosforilazione osservato di tale substrato nel sistema in vitro sopra descritto.
Anche con queste riserve, tuttavia, l'importanza attribuita alla biologia di LRRK2 nella ricerca di Parkinson mette in evidenza l'utilità di questo protocollo come uno strumento prezioso per indagare il comportamento di questa proteina in un ambiente in vitro.
The authors have nothing to disclose.
L'autore è un Parkinson UK Research Fellow (borsa F1002). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla fiducia / MRC chiamata Wellcome comune in premio Neurodegenerazione (WT089698) al Consorzio Malattia di Parkinson Regno Unito (UKPDC) i cui membri sono presso l'Istituto UCL di Neurologia, Università di Sheffield e l'unità Proteine MRC fosforilazione a l'Università di Dundee.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment