Leucine Rich Gjenta Kinase 2 er en stor multidomain kinase, mutasjoner som er den vanligste genetiske årsaken til Parkinsons sykdom. Analyse av kinase aktiviteten til dette proteinet har vist seg å være et viktig redskap i å forstå biologi og dysfunksjon av dette proteinet. I denne artikkelen<em> In vitro</em> Analysering av kinase aktivitet LRRK2 og et utvalg av mutanter er beskrevet, og gir et eksperimentelt system for å undersøke fosforylering av mulige underlag og potensielle dysfunksjon av LRRK2 i sykdom.
Leucine Rich Gjenta Kinase 2 (LRRK2) er en 2527 aminosyre medlem av Roco familie av proteiner, besitter en kompleks, multidomain struktur inkludert en GTPase domene (kalt ROC, for Ras of Complex proteiner) og en kinase domenenavn 1. Oppdagelsen i 2004 av mutasjoner i LRRK2 som forårsaker Parkinsons sykdom (PD) resulterte i LRRK2 være fokus for et stort volum av forskning på sin normale funksjon og hvordan proteinet går galt i sykdomsforløpet staten 2,3. Innledende undersøkelser inn i funksjonen av LRRK2 fokusert på sin enzymatiske aktiviteter 4-6. Selv om et klart bilde har ennå å dukke opp på en konsekvent endring i disse på grunn av mutasjoner, har data fra en rekke grupper fremhevet viktigheten av kinase aktivitet LRRK2 i celledød knyttet til mutasjoner 7,8. Nyere publikasjoner har rapportert hemmere rettet mot kinase aktiviteten til LRRK2, og gir et viktig eksperimentelle verktøy 9-11. I lys av disse dataene, er deter sannsynlig at den enzymatiske egenskaper LRRK2 gir oss et viktig vindu inn i biologien til dette proteinet, selv om de er potensielle narkotika mål for Parkinsons er åpent for debatt.
En rekke ulike tilnærminger har blitt brukt til analysen av kinase aktivitet LRRK2. I begynnelsen var analyser utført med epitop tagget protein overexpressed i mammalske cellelinjer og immunoprecipitated, med analysene utføres ved bruk av dette proteinet immobilisert på agarose perler 4,5,7. Senere har renset rekombinant fragmenter av LRRK2 i løsningen også blitt brukt, for eksempel en GST tagget fragment renset fra insekt cellene inneholder rester 970-2527 av LRRK2 12. Nylig, Daniels et al. Rapporterte isolering av full lengde LRRK2 i løsning fra humane embryonale nyre celler, men dette proteinet er ikke allment tilgjengelig 13.. I kontrast til GST fusjon avkortet form av LRRK2 er kommersielt tilgjengelig fore (fra Invitrogen, se tabell 1 for detaljer), og gir et praktisk verktøy for å demonstrere en analyse for LRRK2 kinase aktivitet. Flere forskjellige utganger for LRRK2 kinase aktivitet har blitt rapportert. Autophosphorylation av LRRK2 selv, fosforylering av Myelin Basic Protein (MBP) som en generisk kinase substrat og fosforylering av en kunstig underlag – kalt LRRKtide, basert på fosforylering av treonin 558 i Moesin – har alle vært brukt, som har en rekke mulige fysiologiske substrater inkludert α-synuclein, Moesin og 4-EBP 14-17. Statusen for disse proteinene som underlag for LRRK2 fortsatt uklart, og som sådan protokollen som er beskrevet nedenfor vil fokusere på å bruke MBP som en generisk substrat, merke nytten av dette systemet til analysen LRRK2 kinase aktivitet rettet mot en rekke potensielle underlag.
Dette notatet beskriver en grunnleggende protokollen for analysere den kinase aktiviteten til LRRK2 hjelp av en in vitro system. Av hensyn til kortfattethet, har dette vært begrenset til en times endepunkt mal å bruke en generisk substrat, men den generelle protokollen er anvendelig til en rekke potensielle underlag, mottakelig for mer sofistikerte analyser undersøke kinetikken av kinase aktivitet LRRK2 . Dette understreker en av de viktigste fordelene ved å bruke en in vitro system for å undersøke kinase oppførsel av et protein som dette: fordi det er full kontroll over konsentrasjonene av enzymet og substratet, er det mulig å generere kinetiske data og beregne K m og V max verdier for reaksjonen. For mer detaljert kinetisk evalueringer eller vurdere effekten av mulige hemmere, er en høyere gjennomstrømning system (som gis ved å bruke LRRKtide underlaget, tilgjengelig fra Invitrogen) en overlegen alternative til den tilnærmingen som er beskrevet her.
Det er imidlertid viktig å erkjenne at den reduksjonistiske modellen systemet leveres av in vitro-kinase analysene er bare ett verktøy for å undersøke biologi av en kinase og dets relasjoner med potensielle underlag. Data fra analyser som dette bør brukes sammen med andre tilnærminger for å få et helhetlig bilde av hvordan en kinase oppfører seg in vitro og i en mobil kontekst. For eksempel kan en antatt substrat fosforylert in vitro bli analysert av massespektrometri for å identifisere mulige phosphosites som så kan manipuleres av målrettet mutagenese (f.eks. Konvertere serin eller treonin fosfat akseptor rester til ikke-phosphorylatable rester som alanin) for å undersøke den funksjonelle Konsekvensene av fosforylering ex vivo.
Et viktig hensyn i tolke data fra en in vitro test system som dette er sannsynligheten for either type I eller type II (falske positive eller falske negative) feil. Den reduksjonistiske natur dette systemet dessverre disponerer den til begge deler – i tilfelle av tidligere, har en renset antatt substrat og renset kinase i kunstig nær hverandre og ved høy konsentrasjon (i forhold til cellular miljøet) kan resultere i artefactual fosforylering hendelser. Omvendt, mange kinaser fungere som en del av et kompleks innenfor rammen av cellen, og krever co-faktorer for fosforylering av et gitt substrat å skje. Som nevnt ovenfor, et positivt resultat fra fosforylering av en antatt underlaget med en in vitro analyse system skal deretter testes i et mobiltelefonnettverk system for å godkjenne resultatet, og et negativt resultat bør tolkes med forsiktighet.
I lys av dette, er det avgjørende der det er mulig å ha både positive og negative kontroller for å tillate en komparativ studie av aktiviteten til din kinase av interesse. Nøye valg av en positiv control som har en kjent aktivitet mot din protein av interesse, sammen med en negativ kontroll som er usannsynlig å phosphorylate din utlagde substrat, er meget verdifull. En kandidat kontroll for LRRK2 er Receptor samhandler 3 kinase, som har et nært beslektet primære sekvensen til kinase domene LRRK2 men har en helt annen overordnet domene struktur 18 år. Denne er tilgjengelig som rekombinant protein fra Invitrogen og brukes som en standard kontroll i vårt laboratorium.
Det bør også bemerkes at de kommersielt tilgjengelig form av LRRK2 mangler N-terminus av proteinet og er merket med glutation-S-transferase og dette bør tas i betraktning som en mulig konfunderende faktor ved gjennomføring av kinase analyser med dette proteinet, som det ikke er kjent hvilken rolle N-terminal av LRRK2 kan spille i normal funksjon av dette proteinet. Hvis for eksempel den N-terminale delen av LRRK2 som er fraværende i protein brukes i denne protokoller avgjørende for rekruttering av en spesifikk substrat til kinase domene LRRK2 da dette vil ha stor innvirkning på de observerte fosforylering av sa substrat i in vitro system er beskrevet ovenfor.
Selv med disse begrensninger, men understreker viktigheten knyttet til biologi LRRK2 i Parkinsons forskning nytten av denne protokollen som et verdifullt verktøy for å undersøke oppførselen til dette proteinet i en in vitro setting.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren er en Parkinsons britiske Research Fellow (tilskudd F1002). Dette arbeidet ble støttet delvis av Wellcome Trust / MRC Joint Call i neurodegeneration award (WT089698) til Storbritannia Parkinsons sykdom Consortium (UKPDC) hvis medlemmer er fra UCL Institute of Neurology, University of Sheffield og MRC Protein fosforylering Unit ved University of Dundee.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment