Лейцин Богатые киназы Повторите 2 является большой киназы многодоменных, мутации в которых наиболее распространенных генетических причин болезни Паркинсона. Анализ активности киназы этого белка оказалась важнейшим инструментом в понимании биологии и дисфункции этого белка. В данной работе<em> В пробирке</em> Опробование киназы деятельности LRRK2 и выбор его мутантов описывается, обеспечивая экспериментальная система для изучения фосфорилирования предполагаемых субстратов и потенциальных дисфункции LRRK2 в болезнь.
Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson’s disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson’s is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Daniëls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate – dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin – have all been used, as have a series of putative physiological substrates including α-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.
Эта статья описывает основные протокол для опробования киназы деятельности LRRK2 использования в системе пробирке. В интересах краткости, это была ограничена один час конечная точка шаблона с помощью универсального субстрата, но общий протокол применяется к кругу потенциальных субстратов и поддаются более сложный анализ изучения кинетики активности киназы LRRK2 . Это подчеркивает одно из ключевых преимуществ использования системы в пробирке для изучения поведения киназы белка, такие как это: потому что есть полный контроль над концентрации фермента и субстрата, можно генерировать кинетических данных и рассчитать К м и макс значения для реакции. Для получения более подробной кинетической оценки или оценки воздействия предполагаемого ингибиторы, более высокая пропускная способность системы (например, той, которая обеспечивается использованием LRRKtide подложку, которую можно получить Invitrogen) является превосходным alternatiве с подходом, описанным здесь.
Важно, однако, признать, что система редукционистской модели, предоставляемой в анализах пробирке киназы является лишь одним из инструментов для изучения биологии киназы и его отношения с потенциальными субстратов. Данные анализов, таких как это должно быть использован в сочетании с другими подходами, чтобы получить полную картину того, как ведет себя киназы в пробирке и в сотовой связи. Например, предполагаемый субстрат фосфорилированных в пробирке могут быть проанализированы масс-спектрометрии для выявления возможных phosphosites, которые затем можно манипулировать направленного мутагенеза (например,. Превращение серина или треонина акцептор фосфата остатки никому-phosphorylatable отходы, такие как аланин) для изучения функционального Последствия фосфорилирования естественных отл.
Ключевым моментом в интерпретации данных в пробирке анализ системы, такие как это вероятность eitheГ типа я или типа II (ложный положительный или ложно отрицательные) ошибок. Редукционистской характер этой системы, к сожалению располагает его к обеим – в случае с бывшей, с очищенной предполагаемый субстрат и очищенный киназы в искусственно непосредственной близости и в высокой концентрации (по сравнению с сотовой среды) может привести к артефактного событий фосфорилирования. И наоборот, многие киназы функционируют как часть комплекса в контексте клетки, и требуют кофакторами для фосфорилирования данного субстрата, чтобы произойти. Как отмечалось выше, положительный результат от фосфорилирования предполагаемого подложку с использованием в системе анализа пробирке должна быть протестирована в системе сотовой для проверки результата, а отрицательный результат следует интерпретировать с осторожностью.
В свете этого, очень важно, где можно иметь как положительные, так и отрицательные элементы управления для сравнительного исследования активности киназы ваш интерес. Тщательный отбор положительных противоречивыел, которая известна активность по отношению к вашей белок, наряду с отрицательным контролем, который вряд ли фосфорилировать ваш предполагаемый субстрат, имеют большую ценность. Один из кандидатов управления LRRK2 является Рецептор взаимодействует киназы 3, которая тесно связана с первичной последовательности киназы области LRRK2 но очень разные общей доменной структуры 18. Эта функция доступна в качестве рекомбинантного белка из Invitrogen и используется в качестве стандартного элемента управления в нашей лаборатории.
Следует также отметить, что коммерчески доступные формы LRRK2 не хватает N-конец белка и помечается глутатион-S-трансферазы, и это должно приниматься во внимание как потенциальных вмешивающихся факторов при проведении анализов киназы с этим белком, как это не известно, какую роль N-терминал LRRK2 могут играть в нормальной функции этого белка. Если, например, N-концевой части LRRK2, которая отсутствует в белке, используемые в настоящем протоколеимеет решающее значение для вербовки специфическим субстратом для киназы области LRRK2 то это будет иметь большое влияние на наблюдаемые фосфорилирование сказал субстрата в пробирке в системе, описанной выше.
Даже с этими оговорками, однако, значение, которое придается биологии LRRK2 в исследования Паркинсона подчеркивает полезность этого протокола, как ценный инструмент для изучения поведения этого белка в пробирке в определении.
The authors have nothing to disclose.
Автор Паркинсона Великобритании научный сотрудник (грант F1002). Эта работа была выполнена при частичной поддержке Велком Траст / MRC Совместный призыв в нейродегенерации награду (WT089698), чтобы болезнь Консорциум Великобритании Паркинсона (UKPDC), члены которого из UCL институт неврологии, Университета Шеффилда и Фосфорилирование MRC белка подразделение в Университет Данди.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment