Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы
Summary
Это протокол, чтобы изолировать активных полный кинезин длиной от<em> Drosophila</em> Эмбрионов для одиночных молекул биофизических исследований. Мы показываем, как собирать эмбрионы, чтобы эмбрион лизат, а затем полимеризации микротрубочек (МТ). Кинезин очищают иммобилизации ее на МТС, летел вниз кинезин-MT комплексов, а затем выпуская кинезин от МТС через того АТФ.
Abstract
Мотор белков транспортировки грузов вдоль микротрубочек, и транспортировать их к конкретным субклеточном местах. Из-за измененного транспорта предлагается лежат в основе различных нейродегенеративных заболеваний, понимание основано микротрубочек автомобильного транспорта и его регулирования, вероятно, в конечном итоге приведет к улучшению терапевтических подходов. Кинезин-1 эукариотических белков двигатель, который движется в антероградная (плюс-концу) направлении вдоль микротрубочек (МТ), питание от гидролиза АТФ. Здесь мы приводим подробный протокол очистки, чтобы изолировать активных полный кинезин длиной от эмбрионов дрозофилы, что позволило сочетание генетики дрозофилы с одной молекулой биофизических исследований. Начиная с примерно 50 прокладки чашки, с примерно 1000 женщин в чашке, мы провели ночь коллекций. Это дало примерно 10 мл упакованы эмбрионов. Эмбрионы были отбеливатель dechorionated (дающим около 9 граммов эмбрионы), а затем гомогенизации. Мтер нарушения, гомогенат уточнил помощью низкой скорости вращения следует высокоскоростного центрифугирования. Уточнить супернатант обрабатывают GTP и таксола к полимеризации МТС. Кинезин был обездвижен на полимеризованный МЦ добавлением АТФ аналоговый, 5'-аденилил imidodiphosphate при комнатной температуре. После кинезин обязательным, микротрубочки были осаждали с помощью высокоскоростного центрифугирования через сахарозы подушке. Микротрубочек осадок затем снова приостановлен, и этот процесс повторяется. Наконец, СПС была добавлена, чтобы освободить кинезин от МТС. Высокая скорость центрифугирования затем остановлен МТС, оставляя кинезин в супернатант. Это кинезин была подвергнута центробежной фильтрации с использованием 100 KD отсечения фильтр для дополнительной очистки, аликвоты, оснастки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 ° C. SDS гель-электрофореза и западных промокательной проводили с использованием очищенного образца. Двигательной активности очищенных образцов до и после окончательного центробежные шаг фильтрацииоценивалась в пробирке один анализ микротрубочек молекулы. Кинезин фракции до и после фильтрации центробежная показал процессивность как сообщалось ранее в литературе. Дальнейшие эксперименты ведутся для оценки взаимодействия между кинезин и других, связанных с транспортом белков.
Protocol
Discussion
Говядина мозга является наиболее широко используется исходный материал очищают от 11 до полнометражных кинезин, хотя мышиного мозга была использована, а 12. Большой недостаток использования бычьего мозга в качестве источника кинезин является наличие свежего исходного мате…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Отдельное спасибо Крис Нгай и Джейсон Del Rio за их поддержку и помощь в этом проекте. Эта работа была поддержана грантом RO1 GM070676 на СПГ.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
