يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق – 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.
تم تطوير مقايسة التصاق micropipette في عام 1998 لقياس ثنائي الأبعاد (2D) مستقبلات يجند حركية ملزمة 1. في مقايسة يستخدم الإنسان خلايا الدم الحمراء (RBC) وأجهزة الاستشعار والتصاق الخلية عرض لواحدة من الجزيئات المتفاعلة. انها توظف المجهرية لجلب RBC في اتصال مع خلية أخرى يعبر عن جزيء التفاعل مع غيرها من المنطقة التي تسيطر على وجه التحديد والوقت لتمكين تشكيل السندات. تم الكشف عن حالة التصاق والاستطالة على سحب RBC الخلايا باستثناء اثنين. من خلال التحكم في كثافة يغاندس ثبتوا على سطح خلايا الدم الحمراء ، يتم الاحتفاظ احتمال الالتصاق في منتصف المدى بين 0 و 1. ويقدر احتمال التصاق من وتيرة الأحداث التصاق في سلسلة من دورات متكررة الاتصال بين خليتين لوقت الاتصال معين. متفاوتة في وقت الاتصال يولد منحنى ملزم. تركيب نموذج احتمالي لمستقبلات يجند رد فعل حركية 1 إلى الربطمنحنى عائدات تقارب معدل 2D وقبالة.
وقد تم التحقق من صحة الفحص باستخدام تفاعلات مستقبلات Fcγ مع نادي مفتش 1-6 و selectins مع يغاندس glycoconjugate 6-9 ، لل integrins مع يغاندس 10-13 ، homotypical كادهيرين ملزمة 14 ، تي مستقبلات الخلية وcoreceptor مع المجمعات الكبرى التوافق النسيجي الببتيد – 15 — 19.
وقد استخدمت هذه الطريقة لقياس أنظمة حركية 2D عوامل البيولوجية والفيزيائية ، مثل الغشاء microtopology 5 ، 2 مرساة الغشاء ، والتوجه الجزيئية وطول 6 ، وتصلب الناقل 9 ، 20 انحناء ، وقوة اعتداءات 20 ، فضلا عن العوامل البيوكيميائية ، مثل جهري من الهيكل الخلوي والغشاء المكروية حيث تتفاعل الجزيئات الموجودة وتنظيم سطح هذه الجزيئات 15،17،19.
الأسلوب كما استخدمت رس دراسة الربط المتزامن لأنواع مستقبلات يجند 3،4 المزدوج ، والتفاعلات trimolecular 19 باستخدام نموذج تعديل 21.
والميزة الرئيسية لهذه الطريقة أنها تسمح دراسة المستقبلات في غشاء بيئتها الأصلية. ويمكن أن تكون النتائج مختلفة جدا عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مستقبلات المنقى 17. كما يسمح دراسة التفاعلات مستقبلات يجند في فترة زمنية الفرعي الثاني للقرار الزمنية إلى ما وراء الأساليب التقليدية البيوكيميائية.
لتوضيح طريقة التصاق micropipette التردد ، وتبين لنا قياس حركية جزيء التصاق بين الخلايا 1 (ICAM – 1) على كرات الدم الحمراء functionalized ملزمة لإنتغرين β α L 2 على العدلات مع مثنوي E – selectin في الحل لتنشيط β α L 2.
لاستخدام بنجاح وتيرة التصاق مقايسة micropipette ينبغي للمرء أن ينظر في اتخاذ خطوات حاسمة عدة. أولا ، تأكد من أن يسجل التفاعل محددة لنظام مستقبلات يجند من الفائدة. قياسات التحكم غير محدد (راجع الشكل رقم 3 ، 4) ضمان النوعية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون احتمالات التصاق غ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL091020 ، R01HL093723 ، R01AI077343 وR01GM096187.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |