Summary

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

Published: November 02, 2011
doi:

Summary

يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق – 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.

Abstract

تم تطوير مقايسة التصاق micropipette في عام 1998 لقياس ثنائي الأبعاد (2D) مستقبلات يجند حركية ملزمة 1. في مقايسة يستخدم الإنسان خلايا الدم الحمراء (RBC) وأجهزة الاستشعار والتصاق الخلية عرض لواحدة من الجزيئات المتفاعلة. انها توظف المجهرية لجلب RBC في اتصال مع خلية أخرى يعبر عن جزيء التفاعل مع غيرها من المنطقة التي تسيطر على وجه التحديد والوقت لتمكين تشكيل السندات. تم الكشف عن حالة التصاق والاستطالة على سحب RBC الخلايا باستثناء اثنين. من خلال التحكم في كثافة يغاندس ثبتوا على سطح خلايا الدم الحمراء ، يتم الاحتفاظ احتمال الالتصاق في منتصف المدى بين 0 و 1. ويقدر احتمال التصاق من وتيرة الأحداث التصاق في سلسلة من دورات متكررة الاتصال بين خليتين لوقت الاتصال معين. متفاوتة في وقت الاتصال يولد منحنى ملزم. تركيب نموذج احتمالي لمستقبلات يجند رد فعل حركية 1 إلى الربطمنحنى عائدات تقارب معدل 2D وقبالة.

وقد تم التحقق من صحة الفحص باستخدام تفاعلات مستقبلات Fcγ مع نادي مفتش 1-6 و selectins مع يغاندس glycoconjugate 6-9 ، لل integrins مع يغاندس 10-13 ، homotypical كادهيرين ملزمة 14 ، تي مستقبلات الخلية وcoreceptor مع المجمعات الكبرى التوافق النسيجي الببتيد – 15 — 19.

وقد استخدمت هذه الطريقة لقياس أنظمة حركية 2D عوامل البيولوجية والفيزيائية ، مثل الغشاء microtopology 5 ، 2 مرساة الغشاء ، والتوجه الجزيئية وطول 6 ، وتصلب الناقل 9 ، 20 انحناء ، وقوة اعتداءات 20 ، فضلا عن العوامل البيوكيميائية ، مثل جهري من الهيكل الخلوي والغشاء المكروية حيث تتفاعل الجزيئات الموجودة وتنظيم سطح هذه الجزيئات 15،17،19.

الأسلوب كما استخدمت رس دراسة الربط المتزامن لأنواع مستقبلات يجند 3،4 المزدوج ، والتفاعلات trimolecular 19 باستخدام نموذج تعديل 21.

والميزة الرئيسية لهذه الطريقة أنها تسمح دراسة المستقبلات في غشاء بيئتها الأصلية. ويمكن أن تكون النتائج مختلفة جدا عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مستقبلات المنقى 17. كما يسمح دراسة التفاعلات مستقبلات يجند في فترة زمنية الفرعي الثاني للقرار الزمنية إلى ما وراء الأساليب التقليدية البيوكيميائية.

لتوضيح طريقة التصاق micropipette التردد ، وتبين لنا قياس حركية جزيء التصاق بين الخلايا 1 (ICAM – 1) على كرات الدم الحمراء functionalized ملزمة لإنتغرين β α L 2 على العدلات مع مثنوي E – selectin في الحل لتنشيط β α L 2.

Protocol

1. كرات الدم الحمراء في الدم من عزلة كاملة تعد قمة شرق اسيا حلول – 45. يصل وزنه جميع المكونات من الجدول الأول وتذوب في 200ml من الماء – 100 DI. إضافة الماء لجعل الحل وضبط درجة الحموضة 1000ml إلى 8.0. تصفية وقسامة بواسطة 50ml. ا?…

Discussion

لاستخدام بنجاح وتيرة التصاق مقايسة micropipette ينبغي للمرء أن ينظر في اتخاذ خطوات حاسمة عدة. أولا ، تأكد من أن يسجل التفاعل محددة لنظام مستقبلات يجند من الفائدة. قياسات التحكم غير محدد (راجع الشكل رقم 3 ، 4) ضمان النوعية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون احتمالات التصاق غ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL091020 ، R01HL093723 ، R01AI077343 وR01GM096187.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue # Comments
10x PBS BioWhittaker

17-517Q

Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA BD 366643 RBCs isolation
10ML PK100      
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 RBCs isolation
Adenine Sigma-Aldrich A2786 EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 EAS-45 preparation
D-Mannitol Sigma-Aldrich 6360 EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (NaHPO) Fisher Scientific S374 EAS-45 preparation
L-glutamine Sigma-Aldrich G5763 EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS Calbiochem 203188 RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF) Thermo Scientific 20673 RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M) Electron Microscopy Sciences 11455-90 RBCs biotinylation
Streptavidin Thermo Scientific 21125 Ligand functionalizing
BSA Sigma-Aldrich A0336 Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads BD Biosciences 340495 Density quantification
Flow cytometer BD Immunocytometry Systems

BD LSR II

Density quantification

Capillary Tube

0.7-1.0mm x 30"
Kimble Glass Inc. 46485-1 Micropipette pulling
Mineral Oil Fisher Scientific BP2629-1 Chamber assembly
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-G Chamber assembly

PE α-human CD11a

Clone HI 111
eBioscience 12-0119-71 Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54 eBioscience 12-0549 Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE eBioscience 12-4714 Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator Narishige MO-303 Micropipette system
Mechanical manipulator Newport 461-xyz-m, SM-13, DM-13 Micropipette system
piezoelectric translator Physik Instrumente P-840 Micropipette system
LabVIEW National Instruments Version 8.6 Micropipette system
DAQ board National Instruments USB-6008 Micropipette system
Optical table Kinetics Systems 5200 Series Micropipette system

References

  1. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
  2. Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
  3. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
  4. Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
  5. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
  6. Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
  7. Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
  8. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
  9. Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
  10. Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
  11. Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
  12. Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
  13. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
  14. Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
  15. Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
  16. Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
  17. Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 .
  18. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
  19. Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
  20. Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
  21. Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
  22. Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
  23. Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
  24. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
  25. Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
  26. Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
  27. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
  28. Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
  29. Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
  30. Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
  31. Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
  32. Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
  33. Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).

View Video