Анализ сцепления частоты для измерения рецептор-лиганд кинетики взаимодействия, когда обе молекулы закреплены на поверхностях взаимодействующих элементов описан. Это механически основе анализа является примером использования микропипетки под давлением человеческого эритроцита, как адгезия датчика и интегрина αLβ2 и межклеточной молекулы адгезии-1 в качестве взаимодействующих рецепторов и лигандов.
Анализ микропипетки адгезии была разработана в 1998 году для измерения двумерной (2D) рецептор-лиганд кинетики 1. Анализ использования человеческих красных кровяных телец (эритроцитов) в качестве датчика сцепления и представления ячейки для одного из взаимодействующих молекул. В нем занято микроманипуляция принести РБК в контакт с другой ячейке, что выражает другой молекулы, взаимодействующие с точно контролируемой зоне и время для включения образования связей. Адгезии событие определяется как относительное удлинение на РБК тянет две ячейки друг от друга. Контролируя плотность лигандов, иммобилизованных на поверхности эритроцитов, вероятность адгезии находится в середине диапазона между 0 и 1. Адгезии вероятность оценивается по частоте адгезии события в последовательности циклов повторный контакт между двумя ячейками для данного времени контакта. Варьируя время контакта создает обязательную кривой. Установка вероятностную модель для рецептор-лиганд кинетику реакции с 1 по обязательнымкривая возвращает 2D близости и вне курса.
Анализа была подтверждена использованием взаимодействия Fcγ рецепторов IgG Fc 1-6, селектины с гликоконъюгата лигандов 6-9, интегрины с лигандами 10-13, homotypical кадгерина обязательной 14, Т-клеточного рецептора и coreceptor с пептида-майор гистосовместимости комплексов 15 – 19.
Метод был использован для количественного правила 2D кинетики биофизических факторов, таких как мембраны microtopology 5, мембранного якоря 2, молекулярной ориентации и длины 6, перевозчик жесткость 9, кривизна 20, и удар силой 20, а также биохимических факторов, такие как модуляторов цитоскелета и мембраны микросреды, где проживают взаимодействующих молекул и поверхности организации этих молекул 15,17,19.
Метод также используется то изучение одновременного связывания двойной рецептор-лиганд видов 3,4 и тримолекулярных взаимодействия 19 с использованием модифицированной модели 21.
Главным преимуществом метода является то, что она позволяет изучение рецепторов в их родной среде мембраны. Результаты могут существенно отличаться от тех, полученные с использованием очищенных рецепторов 17. Она также позволяет изучение рецептор-лиганд в доли секунды сроки с временным разрешением далеко за рамки типичных биохимических методов.
Для иллюстрации частоты микропипетки адгезии методом, мы показываем кинетики измерения межклеточные молекулы адгезии 1 (ICAM-1) функционализированных на эритроциты привязки к интегрина α L β 2 на нейтрофилы с димерных E-селектина в растворе для активации α L β 2.
Чтобы успешно использовать частоты микропипетки адгезии анализа следует учитывать несколько важных шагов. Во-первых, убедитесь, что для записи конкретного взаимодействия рецептор-лиганд системы интересов. Неспецифические контрольные измерения (см. рис. 3, 4) обеспечить специфичность. …
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 и R01GM096187.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |