Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi
Summary
Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.
Abstract
Mikropipet yapışma testinin iki boyutlu (2D) reseptör-ligand bağlayıcı kinetiği 1 ölçmek için 1998 yılında geliştirilmiştir. Tahlil yapışma sensörü ve etkileşen moleküllerin birini sunan hücre gibi bir insan kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanır. RBC, tam kontrol ve bağ oluşumunu sağlamak için diğer etkileşim molekülü ifade başka bir hücre ile temas getirmek için mikromanipülasyon kullanmaktadır. Yapışma olayı birbirinden ayrı iki hücre çekerek üzerine RBC uzama olarak algılanır. RBC yüzeyinde hareketsiz ligandlar yoğunluğu kontrol ederek, yapışma olasılığı 0 ile 1 arasında orta menzilli tutulur. Yapışma olasılığı belirli bir temas süresi için iki hücre arasındaki tekrarlanan temas döngülerinin bir dizi frekans adezyon olaylar tahmin edilmektedir. Zamanla değişen bağlayıcı bir eğri oluşturur. Bağlayıcı reseptör-ligand reaksiyon kinetiği 1 olasılıklı model uydurmaeğrisi 2B yakınlık ve kapatma hızı ile döner.
Assay, IgG Fc 1-6, selektinler glycoconjugate ligandlar 6-9 ligandlar 10-13, homotypical kaderin bağlama 14, peptid ana histokompatibilite kompleksleri 15 ile T hücre reseptör ve coreceptor integrinler Fcγ reseptörleri etkileşim ile onaylanmıştır 19.
Yöntemi, microtopology 5 membran, membran çapa 2, moleküler oryantasyon ve uzunluğu 6, taşıyıcı sertlik 9, eğrilik 20 ve sıkışma kuvveti 20, yanı sıra biyokimyasal faktörler gibi biyofiziksel faktörler, 2D kinetiği düzenlemeleri ölçmek için kullanılan etkileşen moleküllerin bulunduğu iskeleti ve membran mikroçevresinin ve bu moleküller 15,17,19 yüzey örgütü, modülatörler gibi.
Bu yöntem t da kullanılır olmuşturo, değiştirilmiş bir modelini 21 kullanarak çift reseptör-ligand türleri 3,4 aynı anda bağlama, ve 19 trimolecular etkileşimleri çalışma .
Yöntemin en büyük avantajı, kendi ana membran ortamda reseptörlerinin çalışma izin vermesidir. Saflaştırılmış reseptörleri 17 kullanılarak elde edilen sonuçlar çok farklı olabilir. Ayrıca reseptör-ligand etkileşimleri de tipik biyokimyasal yöntemlerin ötesinde zamansal çözünürlüğe sahip bir alt-ikinci ölçeğinde çalışma sağlar.
Mikropipet yapışma frekans yöntemi göstermek için, α L β 2 etkinleştirmek için çözüm dimerik E-selektin ile nötrofil bağlayıcı eritrositlerde integrin α L β 2 Fonksiyonlu hücrelerarası adezyon molekülü 1 (ICAM-1) kinetik ölçüm göstermektedir.
Protocol
Discussion
Biri, bazı kritik adımları düşünmelisiniz mikropipet yapışma frekans testinin başarılı bir şekilde kullanın. Birincisi, faiz reseptör-ligand sistemi için spesifik etkileşim kayıt emin olun. Nonspesifik kontrol ölçümleri (bkz. Şekil 3, 4) özgüllük sağlar. İdeal olarak, nonspesifik yapışma olasılıkları tüm temas süresi süreler için 0.05 altında olmalı ve her zaman noktası için spesifik ve nonspesifik yapışma olasılıklar arasında anlamlı bir fark var. Çift eritrosit yüzey liga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe programı R01HL091020 R01HL093723, R01AI077343 ve R01GM096187 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 .
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
