Summary
Stereotaxic kirurgi på gnagere gir mulighet for målrettet administrasjon av legemidler eller elektrisk stimulering og opptak i våken, oppføre dyr. I denne videoen presentasjonen vil vi demonstrere siste prosessuelle perfeksjonert denne langvarige prosedyre som lykkes bedre overlevelse og redusert post-kirurgisk vekttap.
Abstract
Stereotaxic kirurgi for implantasjon av kanyler inn i bestemte områder av hjernen har i mange tiår vært en meget vellykket eksperimentell teknikk for å undersøke effektene av lokalt manipulert nevrotransmitter og signalveier i våken, oppføre dyr. Videre har stereotaxic implantasjon av elektroder for elektrofysiologiske stimulering og opptak studier vært medvirkende til vår nåværende forståelse av neuroplasticity og hjernen nettverk i oppføre dyr. Stadig økende kunnskap om optimalisering av kirurgiske teknikker i gnagere 1-4, offentlig bevissthet om dyrevelferd og strenge lovverk (f.eks i 2010 EU-direktiv om bruk av forsøksdyr 5) bedt oss å raffinere disse kirurgiske prosedyrer, spesielt med hensyn å implementere nye rutiner for oksygen tilskudd og kontinuerlig overvåking av blod oksygenering og hjertefrekvens nivåer under operasjonen samtinnføre en standardisert protokoll for post-kirurgisk behandling. Våre observasjoner tyder på at disse endringene resulterte i en økt overlevelse og bedring i den generelle tilstanden til dyrene etter operasjonen (f.eks mindre vekttap og en mer aktiv dyr). Denne videoen Presentasjonen vil vise den generelle prosedyrer involvert i denne type stereotaxic kirurgi med spesiell oppmerksomhet til våre mange modifikasjoner. Vi vil illustrere disse kirurgiske prosedyrer hos rotter, men det er også mulig å utføre denne typen kirurgi i mus eller andre små forsøksdyr ved hjelp av spesielle adaptere for stereotaxic apparater seks.
Protocol
Merk: Antiseptisk teknikker bør benyttes under hele prosedyren. Alle instrumenter og materialer (bomull-tipped vattpinner, gasbind, etc.) som skal brukes under operasjonen bør steriliseres ved autoklavering. En kirurgisk maske, hår panser og sterile hansker skal brukes. Arbeidsområdet og stereotaxic apparatet skal rengjøres grundig, og desinfiseres med 70% etanol løsning.
1. Pre-kirurgiske prosedyrer
- Sett opp stereotaxic apparater og alle materialer som trengs. Pre-varme til oppvarming pad.
- Sett kanylen i støtte sin og se om det er rett.
- Slå på gassen system - blanding av luft og oksygen (30-35% av totale vannmengden bør oksygen).
- Vei rotte og administrere anestesien. Vi bruker en blanding av ketamin (37,5 mg / kg) og dexmedetomidin (0,25 mg / kg) injisert subkutant. For ulike anestesi protokoller, se Flecknell 4 og Hellebrekere et al. syv.
- Etter rotte mistet bevisstheten, barbere hodet området går fra ørene til bare i mellom øynene med en elektrisk barberhøvel.
- Plasser rotte på oppvarming pad, med snuten i front av luftslangen. Bruk en oksimeter for å sikre at rotta har en tilstrekkelig oksygentilførsel i blodet nivå (bør ikke slippe <90%). Følg produsentens anvisninger for riktig bruk av utstyr.
- Påfør øyekrem (Duratears Z, Alcon) på begge hornhinnene for å unngå dehydrering.
- Sjekk rotte reflekser (hale refleks eller tå-pinch refleks, som demonstrert i Walantus et al. 8) for å sikre at det blir tilstrekkelig bedøvet. Dersom rotte fortsetter å vise sterke reflekser, kan tilskudd av anestesi være nødvendig.
- Hvis det ikke toe-pinch refleksen vises, plassere rotte i stereotaxic apparatet, justerer øret barene slik at den viser lik lesing på begge sider, og legg igjen luftslangen foran dyretved å feste den med nesa bar. Sjekk igjen hvis rotte viser et blod oksygen nivå på 90% eller høyere. Hvis ikke, juster heller slangen, og bringer den nærmere nesen, eller øke strømmen av oksygen. Overvåk blodet oksygen nivået og hjertefrekvens hele operasjonen.
- Kontinuerlig overvåke rotte temperatur med en rektal termometer (fortrinnsvis koblet til en oppvarming pad) og registrere verdier ved begynnelsen og slutten av operasjonen. Juster oppvarming puten eller bruke et teppe til å opprettholde en kroppstemperatur på 37,5 til 38,5 ° C.
2. Kirurgi
- Injisere smertestillende. Vi bruker en enkel peri-operative forvaltning av carprofen (4,0 til 5,0 mg / kg, subkutant). For ulike smertestillende protokoller, se Hellebrekers et al. Syv.
- Rengjør det barberte området tHan hud fra sentrum til haired omkretsen tre ganger med et desinfeksjonsmiddel (f.eks klorhexidin 0,5%) og lokalt injisere en blanding av lidokain (20 mg / ml) og adrenalin (5 mg / ml) for lokalanestesi og vasokonstriksjon (for å hindre overdreven blødning).
- Lag en anterior-posterior snitt på ca 2,5 cm på midtlinjen av hodebunnen, som går fra mellom øynene inntil baksiden av ørene. Bruk 4-6 bulldog klemmer å klype av huden og for å holde såret åpent. Fjern eventuelle konjunktiv vev med en slikkepott og / eller bomullspinner, og rengjør området for å avdekke skallen overflaten.
- Sjekk om hodet er nivå: Først må du finne Lambda og plasser guide kanyle akkurat over denne plasseringen, rørende skallen. Noter dorso-ventrale koordinat. Deretter plasserer guiden kanylen rett over Bregma, rørende skallen, og registrere sin dorso-ventral koordinat. Disse to koordinater skal være identiske. Dersom forskjellen er> 0,3 mm, juster nese bar å korrigere det.
- MÅke to små hull for å feste hodeskallen skruer med en sterilisert hånd drill (en ca 5 mm anterior til kanylen beliggenhet i et av de halvkuler og de andre 5 mm posteriort for kanylen plasseringen i kontralaterale halvkule). Plasser to sterile skruer inn i disse hullene før de er tett forankret, uten å bli satt helt inn i skallen.
- Med guide kanyle plassert nøyaktig på Bregma, registrere anterior-posterior og lateral koordinater. Den korrekte plasseringen av guide kanyle plassering for hver hjernen regionen kan beregnes ved å legge til eller trekke fra Bregma, med hjelp av en stereotaxic atlas 9-11.
- Plasser guide kanyle i sin riktig sted, litt rørende skallen. Noter dorso-ventrale koordinat. For bilateral kanyle plassering, finner neste kanylen plassering i den andre halvkulen, og igjen ta opp dorso-ventrale koordinat. Begge koordinater skal være identisk (eller avvike <0,3 mm).
- Marker kanylen steder på skallen med en steril blyant, og med hånden driller, gjør graden hullene, sjekke størrelse og riktig sted ved hjelp av veiledningen kanyle. Når hullene er gjort, kan du bruke en steril nål til å forsiktig slå hjernehinnene å tillate fri innsetting av kanyle.
- Sett kanylen inn det første hullet og senk den forsiktig til den når den endelige ventrale koordinere. Klargjør dental sement og generøst bruke den rundt kanyle og en eller begge skruer for å feste kanylen. Vent til sement har tørket helt. Etterpå, fjerner du kanylen støtte ved å vri dorso-ventrale bar oppover.
- Plasser den andre kanylen inn støtten og gå til kanylen plassering i den andre halvkule. Sett kanylen inn i hullet og gjenta forrige trinn. Dekk skruer og en stor overflate av kanyler med sement, og før sement er tørr, fjern eventuelle overskudd fra huden.
- Injiser varmt (~ 37 ° C) sterilt saltvann (~ 10 ml / kg, sc) for å sikre rehydrering.
- Etter at sement har fullstendig tørket, fjernes kanylen støtte og plasser en steril nål i hver kanyle for å unngå hindringer.
- Rengjør såret med sterilt saltvann og sutur foran og bak på såret.
- Fjern dyret fra stereotaxic apparater, erstatte gass slangen foran nesen sin. Fortsett å overvåke oksygenmetning nivå og kroppstemperatur.
- Dersom en injeksjon bedøvelse med dexmedetomidin brukes, injisere sin antagonist atipamezol (0,25 mg / kg, sc) og vente til dyret våkner opp (ca. 5 minutter).
- Plasser rotte inn i et recovery buret. For å unngå hypotermi, plassere buret i en inkubator ved 28 ° C eller på en oppvarming pad på et sted hvor du kan observere dyret i minst en time, før du returnerer den til Vivarium rommet.
3. Post-kirurgisk behandling
- Under de første 4 dagene etter operasjonen, overvåke rotte er frisk ved å holde daglige registreringer av vekt og andre observasjoner om tilstanden til dyret i laboratoriet loggbøker eller "dyrevelferd dagbøker".
- Dyr som viser klare tegn på sykdom, infeksjon i såret, tap av kroppsvekt eller andre tegn på redusert velvære må gjennomgå spesiell omsorg: f.eks en ekstra dose smertestillende for å redusere postoperativ smerte, en blanding av pulver mat og vann i tillegg til standard chow å stimulere rotte appetitt, og / eller en subkutan injeksjon av saltvann for å støtte rehydrering.
- Hvis rotten ikke viser noen bedring etter disse intervensjoner, eller tap av kroppsvekt er> 15% (sammenlignet med pre-kirurgi vekt), ofrer dyret med en overdose bedøvelse (human end-point).
- Rotter trenger vanligvis å gjenopprette i minst 7 dager før oppstart av atferdsmessige eksperimenter.
Fire. Representant Resultater
jove_content "> For å avgjøre om de ulike modifikasjoner av våre kirurgiske prosedyren, spesielt med hensyn til oksygen tilskudd og kontinuerlig overvåking av blod oksygenering nivåer, puls og kroppstemperatur, økt dyrets overlevelse og forbedret sin generelle tilstand etter operasjonen, sammenlignet vi ikke-overlevelse på 20 årskull av dyr (som består av 20 rotter hver) som gjennomgikk operasjon etter at vi implementerte disse modifikasjonene med ikke-overlevelse på 24 kohorter (20 rotter hver) operert med standard protokoll. Som er vist i Figur 1a , de ikke-overlevelse var signifikant redusert i utvalget av årskullene som ble operert med modifisert protokoll (P <0.05; Mann-Whitney U test, to tailed). Dessuten er som vist i Figur 1b, post-kirurgisk vekttap av rotter opererte med den modifiserte protokollen ble også signifikant redusert sammenlignet med rotter operert med standard prosedyre (postoperative dag 1: P <0.05; postoperative dag 2: P <0,01; postoperative dag 3: P = 0.17; Student t-tester).
Figur 1. Effekt av kirurgisk modifikasjoner på ikke-overlevelse og postoperative vekttap. (A.) Ikke-overlevelsen av rotter operert med modifisert protokoll som sammenlignet med rotter operert med standard protokoll. Den ikke-overlevelse (median ± interkvartilt områder) ble beregnet som andel av rotter, per kohort av 20 rotter, som ikke overleve operasjonen. * P <0,05, Mann-Whitney U test to tailed (n = 20 årskull for de modifiserte protokollen og 24 årsklassene for standard protokoll). (B.) Vekttap (gjennomsnitt ± SEM som prosentandel av pre-kirurgi vekt) i løpet av den første (POD1), andre (POD2) og tredje (POD3) postoperative dag. * P <0.05, ** P <0.01, Student t-test (n = 60 per gruppe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne videoen presentasjonen er å sette atferdsmessige nevrologer med de grunnleggende prinsippene i stereotaxic kirurgi. Forskere som allerede utfører stereotaxic kirurgi kan også ha nytte av denne videoen og vurdere noen av de prosessuelle finesser for bruk i sitt eget laboratorium. En stadig økende kunnskap om optimalisering av kirurgiske teknikker 1-3, utvikling av nye anestesi og smertestillende for bruk i human og veterinær 4,12 medisin, offentlig bevissthet om dyrevelferd og strenge lovverk (f.eks i 2010 EU-direktiv om bruk av forsøksdyr 5) bedt oss å implementere nye rutiner for oksygen tilskudd og kontinuerlig overvåking av blod oksygenering og hjertefrekvens nivåer under operasjonen. Vi observerte, som vist for et representativt utvalg av dyr, en samlet økt overlevelse og et betydelig redusert post-kirurgisk vekttap.En slik redusert post-kirurgisk vekttap kan gjenspeile en mindre byrde for den kirurgiske prosedyren på dyret, og følgelig resultere i en mer aktiv dyr i umiddelbar etterkant av operasjonen. Enten det har også gunstige effekter på sitt langsiktige helse er ikke klart. Imidlertid var en bemerkelsesverdig observasjon at fjerning av oksygen midlertidig førte til en markert og pålitelig nedgang i blodet oksygenmetning nivåer, noe som kan falle enda under 50% (Se videopresentasjon for en demonstrasjon herav). Det kan tenkes at langvarig utilstrekkelig blod nivåer av oksygen, muligens som forekommer hos dyr som ikke er levert med noen oksygen tilskudd under operasjonen, kan føre til hypoksi med langvarige atferdsmessige konsekvenser og også negativ innvirkning på utfallet og / eller kvalitet på atferdsmessige eksperimentering. Vi vet ikke om en slik depresjon av oksygen blodforsyning under operasjoner er spesifikk for bedøvelse protokollen som brukes i vårt laboratorium (dvs. en blanding av ketamine og dexmedetomidin) eller om det er et mer generelt fenomen forbundet med injiserbare anestetika. Bruken av inhalering anestesi, med en blanding av luft og oksygen, kan være en alternativ metode å overvinne depresjon av blodet oksygen nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Peter Gerrits for tegningene som brukes i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
