Summary
Стереотаксической хирургии на грызунов позволяет целевой прием препаратов или электрической стимуляции и записи у бодрствующих, которые ведут себя животные. В этом видео-презентации мы продемонстрируем последние процедурные уточнения к этой давней процедура, которая успешно улучшение выживаемости и снижения послеоперационной потери веса.
Abstract
Стереотаксической операции по имплантации катетеров в конкретных областях мозга в течение многих десятилетий была очень успешной экспериментальной методики изучения влияния локально управлять нейромедиаторов и сигнальных путей у бодрствующих, которые ведут себя животные. Более того, стереотаксической имплантации электродов для стимуляции и электрофизиологические исследования записи сыграл важную роль в нашем современном понимании нейропластичности и мозг сетей в себя животных. Постоянно растущее знания об оптимизации хирургической техники у грызунов 1-4, информирование общественности по вопросам благополучия животных и жесткое законодательство (например, в 2010 году Директива Европейского союза об использовании лабораторных животных, 5) предложено уточнить эти хирургические операции, особенно в отношении для внедрения новых процедур для кислородных добавок и непрерывного мониторинга оксигенации крови и уровня частоты сердечных сокращений во время операции, а такжевведение стандартизированного протокола для послеоперационного ухода. Наши наблюдения показывают, что эти изменения привели к увеличению выживаемости и улучшение общего состояния животных после операции (например, менее потеря веса и более активных животных). Это видео презентация покажет общие процедуры, связанные с этим типом стереотаксической хирургии с особым вниманием к нашим нескольких модификациях. Проиллюстрируем эти хирургические операции у крыс, но это также можно выполнять такого рода операции у мышей и других мелких лабораторных животных с помощью специальных адаптеров для стереотаксического аппарата 6.
Protocol
Примечание: Антисептическое методы должны быть использованы в течение всей процедуры. Все инструменты и материалы (хлопок-тампоны, марлевые и т. д.), который будет использоваться во время операции следует стерилизовать в автоклаве. Хирургическую маску, волосы капота и стерильные перчатки. Рабочую зону и стереотаксической аппарата должны быть тщательно очищены и продезинфицированы 70% растворе этанола.
1. Предварительно хирургических процедур
- Настройка стереотаксического аппарата и всех необходимых материалов. Предварительно теплые грелки.
- Место канюли в свою поддержку и проверить, если это прямо.
- Включите газовой системы - смесь воздуха и кислорода (30-35% от общего потока должны быть кислорода).
- Взвесьте крысы и управлять анестезией. Мы используем смесь кетамина (37,5 мг / кг) и dexmedetomidine (0,25 мг / кг) вводили подкожно. Для разных протоколов анестезии см. Flecknell 4 и Hellebrekerс соавт. 7.
- После крыса потеряла сознание, бритье головы область переходе от ушей, чтобы всякий между глаз электробритву.
- Место крысы на грелку, с его носа перед шлангов. Используйте оксиметр для того, чтобы крыса адекватный уровень оксигенации крови (не должна падать <90%). Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя по надлежащему использованию оборудования.
- Применять крем для глаз (Duratears Z, Alcon) с обеих роговицы, чтобы избежать обезвоживания.
- Проверить рефлексы крыс (хвост рефлекс или ног-пинча рефлекс, как показано в Walantus и соавт. 8), чтобы убедиться, что он адекватно наркозом. Если крыса продолжает показывать сильные рефлексы, восполнение анестезия может быть необходимо.
- Если ни один носок-пинча рефлекс показано, место крысы в стереотаксической аппарат, настроить ухо баров, так что она показывает, равное чтению с двух сторон, и место снова шлангов перед животными, фиксируя его с носом бар. Проверьте еще раз, если крыса показывает уровень оксигенации крови на 90% или выше. Если нет, либо настроить труб, приближая его к носу, или увеличить поток кислорода. Монитор уровень оксигенации крови и частоты сердечных сокращений всей операции.
- Постоянно следить за температурой крысы с ректального термометра (преимущественно связаны с грелку) и записывать значения в начале и в конце операции. Отрегулируйте грелку или использовать одеяло для поддержания температуры тела 37,5 до 38,5 ° C.
2. Хирургия
- Inject анальгетик. Мы используем одну пери-оперативном управлении carprofen (4,0-5,0 мг / кг, подкожно). Для разных анальгетик протоколов см. Hellebrekers и соавт. 7.
- Чистая бритой области тОн кожи от центра к периметру волосы в три раза с дезинфицирующим раствором (например, хлоргексидин 0,5%) и на местах вводят смесь лидокаина (20 мг / мл) и адреналина (5 мг / мл) для местной анестезии и вазоконстрикции (для предотвращения чрезмерное кровотечение).
- Убедитесь передне-задний разрез около 2,5 см по средней линии головы, переходя от между глаз до задней части ушей. Используйте 4-6 зажимов бульдога с отщипывать кожу и держать разрез открытым. Удалите любые соединительной ткани с помощью шпателя и / или ватные тампоны и чистой области, чтобы разоблачить поверхности черепа.
- Убедитесь, что голова уровня: во-первых, найти Lambda и место руководства канюли точно на этом месте, касаясь черепа. Запись дорзо-вентральной координат. Далее, поместите руководство канюли точно над брегмы, касаясь черепа, и записать его дорзо-вентральной координат. Эти две координаты должны быть идентичными. Если разница составляет> 0,3 мм, отрегулируйте нос бар, чтобы исправить ее.
- Маке два маленьких отверстия для крепления черепа винты с помощью стерилизованных ручная дрель (одна около 5 мм впереди расположение канюли в одном из полушарий и другие 5 мм кзади от места канюли в контралатеральной полушарии). Поместите два стерильных винты в эти отверстия, пока они не плотно закреплены, не будучи вставлен полностью в череп.
- С руководством канюли помещается ровно в темя, запись передне-задней и боковой координаты. Нужное место размещения руководство канюли для каждой области мозга, может быть вычислена путем сложения или вычитания из брегмы, с помощью стереотаксической атлас 9-11.
- Позиция руководства канюли в правильном месте, слегка касаясь черепа. Запись дорзо-вентральной координат. Для двустороннего размещения канюли, найти следующий расположение канюли в другом полушарии, и снова записывать дорзо-вентральной координат. Обе координаты должны быть одинаковыми (или различаться <0,3 мм).
- Марк канюли местах на череп с карандашом и стерильные, с стороны бурильщика, чтобы заусенцы отверстий, проверяя размеры и правильное расположение с помощью руководства канюли. Как только отверстия сделаны, используйте стерильные иглы, чтобы мягко удар мозговых оболочек, чтобы обеспечить беспрепятственное вставки канюли.
- Место канюли в первое отверстие и опустите его тщательно, пока не достигнет окончательного вентральной координат. Подготовка стоматологического цемента и щедро применяют его вокруг канюли и один или оба винта для закрепления канюли. Подождите, пока цемент полностью высохла. После этого осторожно удалить канюлю поддержки поворотом дорзо-вентральной вверх бар.
- Место второго канюли в поддержке и перейдите в папку канюли в другом полушарии. Место канюли в отверстие и повторите предыдущий шаг. Обложка винты и большая поверхность канюли с цементом, и перед цемента сухим, удалите излишки с поверхности кожи.
- Inject теплой (~ 37 ° С) стерильного физиологического раствора (~ 10 мл / кг, подкожно), чтобы обеспечить регидратации.
- После цемента полностью высохла, удалите поддержку канюли и место стерильную штифт в каждом канюлей для предотвращения обструкции.
- Чистая области раны стерильным физиологическим раствором и шовные передней и задней раны.
- Удалить животное от стереотаксической аппарат, заменяя газ трубы перед ее носом. Продолжайте следить за уровнем насыщения крови кислородом и температуру тела.
- Если инъекционных анестетиков с dexmedetomidine используется, вводят его антагонист атипамезола (0,25 мг / кг, подкожно) и подождите, пока животное просыпается (примерно 5 минут).
- Место крысы в клетке восстановления. Чтобы избежать переохлаждения, место клетке в термостате при 28 ° С или на грелку на место, где можно наблюдать животных в течение по крайней мере один час, прежде чем вернуться его в виварий комнате.
3. Послеоперационный уход
- Во время Первые 4 дня после операции, контролировать восстановление крысы, сохраняя ежедневные записи вес и другие замечания, касающиеся состояния животных в лабораторных журналах или "животных дневники".
- Животные, которые показывают явных признаков болезни, инфекции раны, потеря массы тела или другими признаками уменьшения благосостояния, должны пройти специальный уход: например, дополнительные дозы анальгетиков чтобы свести к минимуму послеоперационные боли, смесь пищевого порошка и воды в дополнение к стандартным кормом для стимуляции аппетита крысы, и / или подкожной инъекции физиологического раствора для поддержки регидратации.
- Если крыса не показывает каких-либо улучшений после этих вмешательств, или потеря массы тела> 15% (по сравнению с предварительно хирургии веса), жертвоприношение животного с передозировка анестетика (гуманный конечная точка).
- Крысы обычно нужно восстановить в течение по крайней мере 7 дней до начала поведенческие эксперименты.
4. Представитель Результаты
jove_content "> Для определения того, различные изменения в нашей хирургической процедуры, в частности в отношении добавок кислорода и непрерывного мониторинга оксигенации крови уровня, частота сердечных сокращений и температуры тела, повышение выживаемости животных и улучшение ее общего состояния после операции, мы сравнили без выживаемость 20 когорт животных (состоящий из 20 крыс каждой), которые сделали операцию после того, мы реализовали эти изменения с не-выживаемость 24 когорт (20 крыс каждая) эксплуатируются со стандартным протоколом. Как показано на рисунке 1а , без выживаемости был значительно сокращен в выборке когорты, что была сделана операция с измененным протоколом (P <0,05; Mann-Whitney U тест, два хвостами). Кроме того, как показано на рисунке 1b, послеоперационной потери веса крыс работает с модифицированный протокол был также значительно сокращены по сравнению с крысами работает со стандартной процедурой (послеоперационный день 1: P <0,05; послеоперационный день 2: Р <0,01; послеоперационный день 3: P = 0,17; Студенческая т-тестов).
Рисунок 1. Влияние хирургического изменения на не-выживаемость и после хирургического снижения веса. (А.) Номера для выживаемость крыс работать с измененной протоколом по сравнению с крысами работает со стандартным протоколом. Без выживаемость (медиана ± межквартильный диапазон) был рассчитан как процент крыс, в когорте из 20 крыс, которые не пережили операцию. * Р <0,05, Mann-Whitney U тест два хвостами (п = 20 когорт для модифицированного протокола и 24 когорт по стандартному протоколу). (Б) Потеря веса (среднее ± SEM в процентах перед операцией вес) во время первого (POD1), второго (POD2) и третьего (POD3) послеоперационный день. * P <0,05, ** P <0,01, студент т-тест (п = 60 в группе).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основная цель этого видео-презентации является ознакомление поведенческого нейрофизиологи с основными принципами стереотаксической хирургии. Исследователи, которые уже выполняет стереотаксической хирургии может также извлечь выгоду из этого видео и рассмотрим некоторые из процедурных уточнений для использования в своей собственной лаборатории. Все возрастающих знаний об оптимизации хирургических методов 1-3, разработка новых анестетиков и анальгетиков для использования в человеческой и ветеринарной медицины 4,12, информирование общественности по вопросам благополучия животных и жесткое законодательство (например, в 2010 году директивы Европейского союза по использование лабораторных животных 5) побудили нас по внедрению новых процедур добавок кислорода и постоянного мониторинга оксигенации крови и уровня частоты сердечных сокращений во время операции. Мы наблюдали, как показано на репрезентативной выборке животных, общее повышение выживаемости и значительное снижение послеоперационной потери веса.Такое снижение послеоперационных потеря веса может отражать меньшее бремя хирургические процедуры на животных и, как следствие, привести к более активным животное сразу же после операции. Будь то также оказывает благоприятное воздействие на его здоровье в долгосрочной перспективе не ясно. Тем не менее, замечательное наблюдение, что удаление кислорода временно привели к значительному и достоверному снижению в крови уровня насыщения крови кислородом, который может упасть даже ниже 50% (см. видео-презентацию для демонстрации настоящего Договора). Можно предположить, что длительное недостаточное содержание в крови кислорода, возможно, встречающихся у животных не предоставили какой-либо добавок кислорода во время операции, может привести к гипоксии с долгосрочными поведенческих последствий, а также негативно сказаться на результатах и / или качества поведенческих экспериментов. Мы не знаем, может ли такое снижение кислорода в крови во время операции, характерные для протокола анестезии используется в нашей лаборатории (например, смесь ketamiпе, dexmedetomidine) или же это более общее явление, связанное с инъекционного наркоза. Использование ингаляционной анестезии, со смесью воздуха и кислорода, может быть альтернативным методом для преодоления депрессии уровень кислорода в крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность д-р Питер Герритс для рисунки, используемые в видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
