Summary
Cirurgia estereotáxica em roedores permite a administração alvo de drogas ou estimulação elétrica e gravações em despertos, comportando-se animais. Neste vídeo de apresentação iremos demonstrar recentes refinamentos processuais para este procedimento de longa data que a taxa de sobrevivência melhorou com sucesso e perda de peso reduzido pós-cirúrgico.
Abstract
Cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas em regiões específicas do cérebro tem por muitas décadas foi uma técnica muito sucesso experimental para investigar os efeitos do neurotransmissor localmente manipulados e vias de sinalização em vigília, os animais se comportando. Além disso, a implantação estereotáxica de eletrodos para a estimulação eletrofisiológica e estudos de gravação tem sido fundamental para a nossa compreensão atual de neuroplasticidade e redes cerebrais no comportamento dos animais. Conhecimento cada vez maior sobre a otimização de técnicas cirúrgicas em roedores 1-4, conscientização pública sobre questões de bem-estar animal e legislação rigorosa (por exemplo, de 2010 a Directiva da União Europeia sobre o uso de animais de laboratório 5) nos levou a aperfeiçoar esses procedimentos cirúrgicos, particularmente com respeito a implementação de novos procedimentos para a suplementação de oxigênio e da monitorização contínua da oxigenação do sangue e os níveis de frequência cardíaca durante a cirurgia, bem comointrodução de um protocolo padronizado para atendimento pós-cirúrgico. Nossas observações indicam que essas modificações resultaram em uma taxa de aumento da sobrevida e uma melhora na condição geral dos animais após a cirurgia (por exemplo, perda de peso menor e um animal mais ativo). Esta apresentação de vídeo vai mostrar os procedimentos gerais envolvidos neste tipo de cirurgia estereotáxica com especial atenção para o nosso várias modificações. Vamos ilustrar esses procedimentos cirúrgicos em ratos, mas também é possível realizar este tipo de cirurgia em ratos ou outros animais de laboratório pequenos usando adaptadores especiais para o aparelho estereotáxico 6.
Protocol
Nota: técnicas de anti-séptico deve ser empregado durante todo o procedimento. Todos os instrumentos e materiais (cotonetes, gazes, etc) que serão utilizados durante a cirurgia deve ser esterilizado em autoclave. A máscara cirúrgica, gorro cabelo e luvas estéreis devem ser usados. A área de trabalho e do aparelho estereotáxico deve ser cuidadosamente limpos e desinfetados com uma solução de etanol 70%.
1. Procedimentos pré-cirúrgicos
- Configurar o aparelho estereotáxico e todos os materiais necessários. Pré-aquecer a almofada de aquecimento.
- Coloque a cânula em seu apoio e verificar se ele é reto.
- Ligue o sistema de gás - mistura de ar ambiente e oxigênio (30-35% do fluxo total deve ser de oxigênio).
- Pesar o rato e administrar o anestésico. Estamos usando uma mistura de cetamina (37,5 mg / kg) e dexmedetomidina (0,25 mg / kg) administrado por via subcutânea. Para protocolos de anestesia diferente, consulte Flecknell 4 e Hellebrekers et al. 7.
- Após o rato perdeu a consciência, raspar a área que vai da cabeça ouvidos apenas entre os olhos com um barbeador elétrico.
- Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento, com o nariz na frente do tubo de ar. Use um oxímetro para garantir que o rato tem um nível de oxigenação adequada do sangue (não deve cair <90%). Por favor, siga as instruções do fabricante para a utilização correcta do equipamento.
- Aplicar creme para os olhos (Duratears Z, Alcon) em ambas as córneas para evitar a desidratação.
- Verificar os reflexos do rato (cauda reflexo ou dedo do pé pinch-reflex, como demonstrado no Walantus et al. 8) para garantir que ele seja adequadamente anestesiados. Se o rato continua a mostrar reflexos fortes, a suplementação de anestesia pode ser necessária.
- Se nenhum reflexo toe pinch é mostrado, coloque o rato no aparelho estereotáxico, ajustar as barras de ouvido para que ele mostra a leitura igual em ambos os lados, e coloque novamente o tubo de ar na frente do animalfixando-a com a barra de nariz. Verifique novamente se o rato mostra um nível de oxigenação do sangue de 90% ou mais. Se não, ajuste ou a tubulação, aproximando-a do nariz, ou aumentar o fluxo de oxigênio. Monitorar o nível de oxigenação do sangue e da freqüência cardíaca durante a cirurgia.
- Monitorar continuamente a temperatura do rato com um termômetro retal (preferencialmente ligado a uma almofada de aquecimento) e registre os valores no início e no final da cirurgia. Ajuste a almofada de aquecimento ou usar um cobertor para manter uma temperatura corporal de 37,5 a 38,5 ° C.
2. Cirurgia
- Injetar o analgésico. Estamos usando uma administração peri-operatória única de carprofeno (4,0-5,0 mg / kg, por via subcutânea). Para diferentes protocolos analgésicos, ver Hellebrekers et al. 7.
- Limpar a área raspada de tele pele do centro para o perímetro cabelos três vezes com um desinfectante (por exemplo, clorexidina 0,5%) e localmente injetar uma mistura de lidocaína (20 mg / ml) e adrenalina (5 mg / ml) para anestesia local e vasoconstrição (para evitar sangramento excessivo).
- Faça uma incisão ântero-posterior de cerca de 2,5 cm na linha média do couro cabeludo, passando de entre os olhos até a parte de trás das orelhas. Use grampos 06/04 bulldog para beliscar fora da pele e manter a incisão aberta. Remover qualquer tecido conjuntivo com uma espátula e / ou cotonetes e limpe a área para expor a superfície do crânio.
- Verifique se a cabeça é o nível: Primeiro, encontre Lambda e coloque a cânula guia exatamente sobre esse local, tocando o crânio. Registro a coordenada dorso-ventral. Em seguida, coloque a cânula guia exatamente sobre bregma, tocando o crânio, e registrar sua coordenada dorso-ventral. Estas duas coordenadas devem ser idênticos. Se a diferença for> 0,3 mm, ajuste a barra de nariz para corrigir isso.
- Make dois pequenos furos para a fixação dos parafusos de caveira usando uma broca de mão esterilizados (um milímetro de aproximadamente 5 para o local anterior cânula em um dos hemisférios e os outros 5 mm posterior ao local da cânula no hemisfério contralateral). Coloque dois parafusos estéril nestes buracos até que eles estão bem ancoradas, sem estar completamente inserida dentro do crânio.
- Com a cânula guia colocado exatamente no bregma, gravar as coordenadas ântero-posterior e lateral. O local correto da guia colocação cânula para cada região do cérebro pode ser calculado somando ou subtraindo bregma, com a ajuda de um atlas estereotáxico 9-11.
- Posição da cânula guia no seu local correto, ligeiramente tocando o crânio. Registro a coordenada dorso-ventral. Para a colocação de cânula bilateral, encontrar próxima do local da cânula no outro hemisfério, e novamente recorde a coordenada dorso-ventral. Ambas as coordenadas devem ser idênticos (ou diferir <0,3 mm).
- Marque os locais cânula no crânio com um lápis estéril e, com o perfurador de mão, fazer os furos rebarba, verificar o tamanho ea localização correta com a ajuda da cânula guia. Uma vez que os buracos são feitos, use uma agulha estéril para perfurar o meninges suavemente para permitir a inserção desobstruída da cânula.
- Coloque a cânula no orifício primeiro e abaixá-lo com cuidado até que ele atinja a cota final ventral. Prepare o cimento dental e generosamente aplicá-la ao redor da cânula e um ou dois parafusos para fixar a cânula. Aguarde até que o cimento secar por completo. Depois, remova cuidadosamente o apoio cânula girando para cima dorso-ventral bar.
- Coloque a cânula segundo para o apoio e vá até o local da cânula no outro hemisfério. Coloque a cânula no orifício e repita o passo anterior. Cobrir os parafusos e uma grande superfície das cânulas com o cimento, e antes que o cimento secar, retirar qualquer excesso da pele.
- Injetar quente (~ 37 ° C) solução salina estéril (~ 10 ml / kg, sc) para garantir a reidratação.
- Depois que o cimento esteja completamente seca, retire o apoio cânula e coloque um alfinete estéril em cada cânula para evitar obstrução.
- Limpar a área da ferida com solução salina estéril e sutura da frente e as costas da ferida.
- Remover o animal do aparelho estereotáxico, substituindo a tubulação de gás na frente de seu nariz. Continuar a acompanhar o nível de saturação de oxigênio e temperatura corporal.
- Se um anestésico injetável com dexmedetomidina é usada, injetam sua atipamezol antagonista (0,25 mg / kg, sc) e aguarde até que o animal acorda (aproximadamente 5 minutos).
- Coloque o rato em uma gaiola de recuperação. Para evitar a hipotermia, coloque a gaiola em uma incubadora a 28 ° C ou em uma almofada de aquecimento em um lugar onde você pode observar o animal por pelo menos uma hora, antes de retornar à sala de viveiro.
3. Cuidados pós-cirúrgicos
- Durante os primeiros 4 dias após a cirurgia, monitor de recuperação do rato, mantendo os registros diários de peso e outras observações a respeito da condição do animal em laboratório ou diários de bordo "diários bem-estar animal".
- Animais que mostram sinais evidentes de infecção doença, do ferimento, perda de peso corporal ou outros sinais de redução de bem-estar devem ser submetidos a cuidados especiais: por exemplo, uma dose extra de analgésicos para minimizar a dor pós-operatória, uma mistura de alimentos em pó e água além de ração padrão para estimular o apetite do rato, e / ou uma injecção subcutânea de solução salina para apoiar a reidratação.
- Se o rato não mostra qualquer melhora após essas intervenções, ou a perda de peso corporal é> 15% (em comparação à cirurgia pré-peso), o sacrifício do animal com uma overdose de anestésico (humana ponto final).
- Ratos normalmente precisam de recuperar, pelo menos, sete dias antes do início dos experimentos comportamentais.
4. Resultados representante
> jove_content "Para determinar se a várias modificações ao nosso procedimento cirúrgico, particularmente com relação à suplementação de oxigênio e do monitoramento contínuo dos níveis sanguíneos de oxigenação, freqüência cardíaca e temperatura corporal, maior a sobrevida do animal e melhorou sua condição geral após a cirurgia, foram comparados os não-sobrevivência taxa de 20 grupos de animais (composto de 20 ratos cada) que foram submetidos à cirurgia depois que implementou essas modificações com a taxa de sobrevivência não de 24 coortes (20 ratos cada) operado com o protocolo padrão. Como é mostrado na Figura 1a , a taxa de sobrevivência não foi significativamente reduzida na amostra de coortes que foi operado com o protocolo modificado (P <0,05; Mann-Whitney, duas caudas). Além disso, como é mostrado na Figura 1b, perda de peso pós-cirúrgica de ratos operados com o protocolo modificado também foi significativamente reduzida quando comparada com a de ratos operados com o procedimento normal (dia pós-operatório 1: P <0,05; dia pós-operatório 2: P <0,01; dia pós-operatório 3: P = 0,17; Student t-tests).
Figura 1. Efeito de modificações cirúrgicas sobre a não-sobrevivência taxa e pós-cirúrgico de perda de peso. (A.) taxa de não-sobrevivência de ratos operados com o protocolo modificado em comparação com a de ratos operados com o protocolo padrão. A taxa de não-sobrevivência (média ± interquartil faixas) foi calculado como o percentual de ratos, por coorte de 20 ratos, que não sobreviveu a cirurgia. * P <0,05, Mann-Whitney bicaudal (n = 20 coortes para o protocolo modificado e 24 coortes para o protocolo padrão). (B) A perda de peso (média ± EPM em percentagem do peso pré-cirurgia), durante o primeiro (Pod1), segundo (POD2) e terceira (POD3) dia pós-operatório. * P <0,05, ** P <0,01, teste t de Student (n = 60 por grupo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O principal objectivo desta apresentação de vídeo é familiarizar os neurocientistas comportamentais com os princípios básicos da cirurgia estereotáxica. Pesquisadores que já estão realizando a cirurgia estereotáxica pode também beneficiar deste vídeo e considerar alguns dos refinamentos processuais para o uso em seu próprio laboratório. Um conhecimento cada vez maior sobre a otimização de técnicas cirúrgicas 1-3, o desenvolvimento de novos anestésicos e analgésicos para uso em medicina humana e veterinária 4,12, a conscientização pública sobre questões de bem-estar animal e legislação rigorosa (por exemplo, de 2010 a Directiva da União Europeia sobre a uso de animais de laboratório 5) nos levou a implementar novos procedimentos para a suplementação de oxigênio e da monitorização contínua da oxigenação do sangue e os níveis de frequência cardíaca durante a cirurgia. Observamos, como mostrado por uma amostra representativa de animais, um aumento da taxa de sobrevida global e uma perda de peso reduziu significativamente pós-cirúrgico.Como uma perda de peso reduzido pós-cirúrgico pode refletir uma menor carga do procedimento cirúrgico no animal e, conseqüentemente, resultar em um animal mais ativo no rescaldo da cirurgia. Se ele também tem efeitos benéficos sobre sua saúde a longo prazo não está claro. No entanto, uma observação notável foi que a remoção do suprimento de oxigênio temporariamente levou a uma diminuição acentuada e confiável nos níveis de saturação de oxigênio no sangue, o que poderia cair ainda abaixo de 50% (Veja o vídeo de apresentação para uma demonstração deste documento). É concebível que os níveis sanguíneos prolongados inadequada de oxigênio, possivelmente ocorrendo em animais não fornecido com qualquer suplementação de oxigênio durante a cirurgia, pode resultar em hipóxia com conseqüências de longo prazo comportamental e também um impacto negativo sobre o resultado e / ou qualidade de experimentação comportamental. Não sabemos se tal uma depressão de fornecimento de oxigênio no sangue durante a cirurgia é específico para o protocolo anestésico utilizado em nosso laboratório (ou seja, uma mistura de ketamine e dexmedetomidina) ou se é um fenômeno mais geral associada com anestésicos injetáveis. O uso de anestesia inalatória, com uma mistura de ar ambiente e oxigênio, pode ser um método alternativo para superar a depressão dos níveis de oxigênio no sangue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Gerrits Dr. Peter para os desenhos usados no vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
