Summary
Cirugía estereotáxica en roedores permite la administración dirigida de fármacos o estimulación eléctrica y las grabaciones en despertar, comportándose animales. En este video de presentación que mostrará los últimos refinamientos de procedimiento para este procedimiento desde hace mucho tiempo que la tasa de éxito mejora la supervivencia y reduce post-quirúrgico de pérdida de peso.
Abstract
Cirugía estereotáxica para la implantación de cánulas en regiones específicas del cerebro durante muchas décadas ha sido una técnica experimental muy exitoso para investigar los efectos de los neurotransmisores a nivel local manipulado y vías de señalización en animales despiertos, de comportarse. Por otra parte, la implantación estereotáxica de electrodos para la estimulación electrofisiológica y estudios de grabación ha sido fundamental para nuestra comprensión actual de la neuroplasticidad del cerebro y las redes de comportarse animales. Conocimiento cada vez mayor sobre la optimización de las técnicas quirúrgicas en los roedores 1-4, sensibilización del público sobre temas de bienestar animal y la estricta legislación (por ejemplo, la Directiva 2010 de la Unión Europea sobre el uso de animales de laboratorio, 5) nos ha llevado a perfeccionar los procedimientos quirúrgicos, especialmente con respecto a la aplicación de nuevos procedimientos para la administración de suplementos de oxígeno y la monitorización continua de oxigenación de la sangre y los niveles de frecuencia cardíaca durante la cirugía, así comola introducción de un protocolo estandarizado para la atención postquirúrgica. Nuestras observaciones indican que estas modificaciones dio lugar a una mayor tasa de supervivencia y una mejora en la condición general de los animales después de la cirugía (por ejemplo, pérdida de peso y menos un animal más activo). Esta presentación en video se muestran los procedimientos generales involucrados en este tipo de cirugía estereotáxica, con especial atención a nuestras varias modificaciones. Vamos a ilustrar estos procedimientos quirúrgicos en ratas, pero también es posible llevar a cabo este tipo de cirugía en los ratones y otros pequeños animales de laboratorio mediante el uso de adaptadores especiales para el aparato estereotáxico 6.
Protocol
Nota: Las técnicas de antisépticos deben ser empleadas durante todo el procedimiento. Todos los instrumentos y materiales (con puntas de algodón, gasas, etc) que serán utilizados durante la cirugía debe ser esterilizado en autoclave. Una máscara quirúrgica, sombrero de pelo y guantes estériles deben ser usados. El área de trabajo y el aparato estereotáxico deben ser limpiados a fondo y desinfectar con una solución de etanol al 70%.
1. Pre-quirúrgicos
- La instalación del equipo estereotáxico y todos los materiales necesarios. Pre-caliente el cojín eléctrico.
- Coloque la cánula en su apoyo y comprobar si es recta.
- Encienda el sistema de gas - mezcla de aire ambiente y el oxígeno (30-35% del flujo total debe ser de oxígeno).
- Pesar las ratas y administrar el anestésico. Estamos utilizando una mezcla de ketamina (37,5 mg / kg) y la dexmedetomidina (0.25 mg / kg) inyectado por vía subcutánea. Para los protocolos de anestesia diferente, consulte Flecknell 4 y Hellebrekers et al. 7.
- Después de la rata perdió el conocimiento, afeitar el área de la cabeza va desde las orejas hasta justo entre los ojos con una maquinilla de afeitar eléctrica.
- Coloque el ratón sobre el cojín eléctrico, con su nariz en la parte delantera del tubo de aire. Use un oxímetro para asegurar que la rata tiene un nivel de oxigenación de la sangre adecuada (no debe caer <90%). Por favor, siga las instrucciones del fabricante para el uso adecuado del equipo.
- Aplicar crema para los ojos (Duratears Z, Alcon) en ambas córneas para evitar la deshidratación.
- Revisar los reflejos de la rata (cola de reflejos o reflejo de los pies-una pizca, como se demuestra en Walantus et al. 8) para asegurarse de que está adecuadamente anestesiado. Si la rata sigue mostrando buenos reflejos, la suplementación de la anestesia podría ser necesaria.
- Si no hay reflejo de los pies-pinch se muestra, el lugar de la rata en el aparato estereotáxico, ajustar las barras de oído por lo que señala un valor igual en ambos lados, y el lugar de nuevo el tubo de aire en la parte delantera del animalfijándolo con la barra de la nariz. Compruebe de nuevo si la rata muestra un nivel de oxigenación de la sangre del 90% o más. Si no es así, ajustar bien el tubo, de acercarla a la nariz, o aumentar el flujo de oxígeno. Monitorear el nivel de oxigenación de la sangre y el ritmo cardíaco durante la cirugía.
- Un seguimiento continuo de la temperatura de la rata con un termómetro rectal (preferentemente conectado a una almohadilla térmica) y registre los valores al inicio y al final de la cirugía. Ajuste el cojín eléctrico o usar una manta para mantener una temperatura corporal de 37,5 a 38,5 ° C.
2. Cirugía
- Inyectar el analgésico. Estamos utilizando un solo peri-operatorio administración de carprofeno (4,0 a 5,0 mg / kg, vía subcutánea). Para los diferentes protocolos analgésicos, consulte Hellebrekers et al 7..
- Limpie el área afeitada de tque la piel desde el centro hasta el perímetro del cabello tres veces con un desinfectante (por ejemplo, la clorhexidina al 0,5%) y el local se inyecta una mezcla de lidocaína (20 mg / ml) y adrenalina (5 mg / ml) para la anestesia local y la vasoconstricción (para evitar sangrado excesivo).
- Hacer una incisión antero-posterior de unos 2,5 cm en la línea media del cuero cabelludo, al pasar de entre los ojos hasta la parte de atrás de las orejas. Use 4-6 bulldogs para desprender la piel y mantener la incisión abierta. Eliminar cualquier tejido conjuntivo, con una espátula y / o un trozo de algodón y limpie la zona para exponer la superficie del cráneo.
- Compruebe si la cabeza es el nivel: En primer lugar, encontrar Lambda y el lugar de la cánula guía exactamente en este lugar, tocar el cráneo. Registro de la coordenada dorso-ventral. Luego, coloque la cánula guía exactamente sobre Bregma, tocar el cráneo, y registrar su dorso-ventral de coordenadas. Estas dos coordenadas deben ser idénticos. Si la diferencia es> 0,3 mm, ajuste de la barra de la nariz para corregirlo.
- Make dos pequeños agujeros para la fijación de los tornillos del cráneo con un taladro de mano esterilizada (un aproximado de 5 mm por delante de la ubicación de la cánula en uno de los hemisferios y la otra de 5 mm por detrás de la ubicación de la cánula en el hemisferio contralateral). Coloque dos tornillos estériles en estos agujeros hasta que estén bien anclados, sin que se inserta por completo en el cráneo.
- Con la cánula guía colocada exactamente en Bregma, registrar las coordenadas antero-posterior y lateral. La ubicación correcta de guiar la colocación de la cánula para cada región del cerebro se puede calcular sumando o restando de Bregma, con la ayuda de un atlas estereotáxico 11.09.
- La posición de la cánula guía en su posición correcta, un poco tocar el cráneo. Registro de la coordenada dorso-ventral. Para la colocación de la cánula bilateral, encontrará a continuación la ubicación de la cánula en el otro hemisferio, y de nuevo registro de la coordenada dorso-ventral. Ambas coordenadas deben ser idénticos (o difieren <0,3 mm).
- Marque la ubicación de la cánula en el cráneo con un lápiz y estériles, con el perforador mano, hacer los agujeros de rebabas, comprobar el tamaño y la ubicación correcta con la ayuda de la cánula guía. Una vez que los agujeros se hacen, use una aguja estéril para golpear suavemente las meninges para permitir la inserción de la cánula sin obstrucciones.
- Coloque la cánula en el primer agujero y baja con cuidado hasta que llega a la coordenada ventral final. Preparar el cemento dental y generosa que se aplican alrededor de la cánula y uno o dos tornillos para fijar la cánula. Espere hasta que el cemento se ha secado por completo. A continuación, retire con cuidado el soporte de cánulas girando la barra de arriba dorso-ventral.
- Coloque la segunda cánula en el apoyo y vaya a la ubicación de la cánula en el otro hemisferio. Coloque la cánula en el orificio y repita el paso anterior. Cubrir los tornillos y una gran superficie de las cánulas con el cemento, y antes de que el cemento esté seco, retire cualquier excedente de la piel.
- Se inyecta agua tibia (~ 37 ° C) de solución salina estéril (~ 10 ml / kg, sc) para asegurar la rehidratación.
- Después de que el cemento se ha secado completamente, retire el soporte de cánulas y colocar un pin estéril en cada una cánula para evitar la obstrucción.
- Limpie el área de la herida con solución salina estéril y sutura de la parte delantera y la parte posterior de la herida.
- Quite el animal del aparato estereotáxico, en sustitución de la tubería de gas frente a su nariz. Continuará monitoreando el nivel de saturación de oxígeno y la temperatura corporal.
- Si una inyección de anestesia con dexmedetomidina se utiliza, inyecta su atipamezol antagonista (0,25 mg / kg, sc) y esperar hasta que el animal se despierta (aproximadamente 5 minutos).
- Lugar a la rata en una jaula de recuperación. Para evitar la hipotermia, colocar la jaula en una incubadora a 28 ° C o en un cojín de la calefacción en un lugar donde se puede observar al animal por lo menos una hora, antes de regresar a la sala de vivero.
3. La atención postquirúrgica
- Durante los primeros 4 días después de la cirugía, supervisar la recuperación de la rata por llevar registros diarios de peso y otras observaciones sobre la condición del animal en el diario de laboratorio o "diarios de bienestar de los animales".
- Los animales que muestren signos evidentes de enfermedad, infección de la herida, la pérdida de peso corporal y otros signos de reducción de la atención del bienestar debe someterse a especiales: por ejemplo, una dosis extra de analgésicos para disminuir el dolor postoperatorio, una mezcla de alimentos en polvo y agua además de la comida estándar para estimular el apetito de las ratas, y / o una inyección subcutánea de solución salina para apoyar a la rehidratación.
- Si la rata no mostró ninguna mejora después de estas intervenciones, o la pérdida de peso corporal es> 15% (en comparación con el peso antes de la cirugía), el sacrificio del animal con una sobredosis de anestésico (humana de punto final).
- Las ratas en general tienen que recuperar por lo menos 7 días antes del comienzo de los experimentos de comportamiento.
4. Resultados representante
jove_content "> Para determinar si las diversas modificaciones a nuestro procedimiento quirúrgico, especialmente en relación con suplemento de oxígeno y el monitoreo continuo de los niveles de oxigenación de la sangre, la frecuencia cardíaca y la temperatura corporal, el aumento de la supervivencia del animal y la mejora de su estado general después de la cirugía, se comparó la no la tasa de supervivencia de 20 cohortes de animales (que consta de 20 ratas cada uno) que se sometieron a cirugía después de que hemos implementado estas modificaciones con la tasa de no supervivencia de 24 cohortes (20 ratas cada uno) que opera con el protocolo estándar. Como se muestra en la Figura 1a , la tasa de supervivencia no se redujo significativamente en la muestra de cohortes que se opera con el protocolo modificado (P <0,05; Mann-Whitney U test, dos colas). Además, como se muestra en la Figura 1b, post-quirúrgico de pérdida de peso de ratas operadas con el protocolo modificado también se redujo significativamente en comparación con la de las ratas operadas con el procedimiento habitual (después de la operación el día 1: p <0,05; día post-operatorio 2: p <0,01; día post-operatorio 3: P = 0,17; pruebas t de Student).
Figura 1. Efecto de las modificaciones quirúrgicas sobre la no la tasa de supervivencia post-quirúrgica y la pérdida de peso. (A.) no la tasa de supervivencia de ratas operadas con el protocolo modificado en comparación con la de las ratas operadas con el protocolo estándar. La tasa de no supervivencia (mediana ± rangos intercuartil) fue calculado como el porcentaje de ratas, por cohorte de 20 ratas, que no sobrevivieron a la cirugía. * P <0,05, Mann-Whitney de dos colas (n = 20 cohortes para el protocolo modificado y las cohortes de 24 para el protocolo estándar). (B) Pérdida de peso (media ± SEM como porcentaje del peso antes de la cirugía) en los primeros (Pod1), segundo (POD2) y tercero (POD3) días después de la operación. * P <0,05, ** P <0,01, prueba t de Student (n = 60 por grupo).
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Discussion
El objetivo principal de esta presentación en video es familiarizar a los neurólogos del comportamiento con los principios básicos de la cirugía estereotáxica. Los investigadores que ya están realizando la cirugía estereotáxica también podrían beneficiarse de este vídeo y considerar algunas de las mejoras de procedimiento para el uso en su propio laboratorio. Un conocimiento cada vez mayor sobre la optimización de las técnicas quirúrgicas 1-3, el desarrollo de nuevos anestésicos y analgésicos para el uso en humanos y veterinaria 4,12, sensibilización del público sobre temas de bienestar animal y la estricta legislación (por ejemplo, la Directiva 2010 de la Unión Europea sobre la uso de animales de laboratorio, 5) nos llevó a poner en práctica nuevos procedimientos para la administración de suplementos de oxígeno y la monitorización continua de oxigenación de la sangre y los niveles de frecuencia cardíaca durante la cirugía. Hemos observado, como se muestra en una muestra representativa de los animales, un aumento de la tasa general de supervivencia y una reducción significativa después de la cirugía de pérdida de peso.Tal posquirúrgica reducida pérdida de peso podría reflejar una menor carga de la intervención quirúrgica del animal y, en consecuencia, dar lugar a un animal más activo en el período inmediatamente posterior a la cirugía. Si también tiene efectos beneficiosos sobre su salud a largo plazo no está claro. Sin embargo, una observación notable fue que la eliminación del suministro de oxígeno temporal llevó a una marcada disminución y fiable de los niveles de saturación de oxígeno en la sangre, que podría caer incluso por debajo del 50% (ver el video de presentación para una demostración del mismo). Es concebible que la prolongación de los niveles inadecuados de oxígeno, tal como ocurre en animales no siempre con cualquier suplemento de oxígeno durante la cirugía, podría resultar en hipoxia con consecuencias a largo plazo del comportamiento y también un impacto negativo en el resultado y / o calidad de la experimentación del comportamiento. No sabemos si esa depresión de suministro de oxígeno en sangre durante la cirugía es específica para el protocolo de anestesia utilizada en nuestro laboratorio (es decir, una mezcla de ketamine y dexmedetomidina) o si se trata de un fenómeno más general asociada con anestésicos inyectables. El uso de la anestesia por inhalación, con una mezcla de aire ambiente y oxígeno, podría ser un método alternativo para superar la depresión de los niveles de oxígeno en la sangre.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Peter Gerrits de los dibujos utilizados en el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
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- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
