Summary
对啮齿动物的立体定向手术允许的药物或电刺激和录音清醒，表现动物的有针对性的管理。在这个视频演示，我们将展示最新的程序上的修改这一长期的过程，成功地提高生存率和降低手术后的减肥。
Abstract
立体定向手术植入到特定的大脑区域的套管已经几十年来，是一个非常成功的实验技术，以调查当地操纵的神经递质和信号转导通路中清醒，表现动物的影响。此外，立体植入电刺激电极和记录研究已有助于我们的神经可塑性和表现动物的大脑网络理解。外科技术在啮齿动物1-4，公众意识的动物福利问题，并严格的立法（例如，2010年欧盟指令对实验动物的使用 5）优化的知识不断增加，促使我们改进，特别是关于这些手术过程中，手术过程中实施新的程序，补充氧气和连续监测血氧和心率水平以及引入了手术后的护理的标准化协议。我们的观察表明，这些修改增加生存率和改善在手术后的动物的一般状况（如减肥和更积极的动物）。此视频演示将显示在此特别注意的若干修改的立体定向手术所涉及的一般程序。我们将说明这些大鼠的外科手术，但它也可以执行在老鼠或其他小实验动物，通过使用特殊的立体定位仪6适配器，这种类型的手术。
Protocol
注：防腐技术，应该在整个过程中就业。手术过程中，将使用所有的工具和材料（棉拭子，纱布等），应通过高压灭菌消毒。应戴口罩，头发的帽子和无菌手套。工作区和立体定位仪上，应彻底清洗，并用70％乙醇溶液消毒。
1。手术前程序
- 设立立体定位仪和所需的所有材料。预温加热垫。
- 将在其支持的套管，并检查它是否是直线。
- 打开气系统 - 环境空气和氧气（总流量的30-35％是氧气）的混合物。
- 称取大鼠和管理的麻醉。我们使用的是皮下注射氯胺酮（37.5毫克/千克）和右旋美托咪啶（0.25毫克/千克）的混合物。不同麻醉协议，看到Flecknell 4和HellebrekerS 等人。7。
- 大鼠后失去了知觉，刮胡子的头部区域，从耳朵之间只是在一个电动剃须刀的眼睛。
- 将加热垫的大鼠，其在气管前面的鼻子。使用血氧饱和度，以确保对大鼠有足够的血氧水平（不应该下降<90％）。请按照正确使用设备制造商的指示。
- 眼霜（Duratears Z，爱尔康）申请在两个眼角膜，以避免脱水。
- 检查老鼠的反射（尾反射或脚趾捏反射，Walantus 等8所示），以确保它有足够的麻醉。如果大鼠继续显示出强劲的反射，可能需要补充麻醉。
- 如果没有脚趾捏反射显示，大鼠放置在立体定位仪，调整耳酒吧，所以，它显示了双方平等的阅读，再次发生空气管在前面的动物固定用鼻子栏。再次检查，如果老鼠显示血氧水平的90％或更高。如果没有，油管调整，使其更接近鼻子，或增加氧气流量。监测血氧水平在整个手术和心脏率。
- 连续监测大鼠直肠温度计（优先连接到一个加热垫）的温度，并记录手术开始和结束的值。调整加热垫或使用毛毯保持体温为37.5到38.5 ° C。
2。外科
- 注入的镇痛。我们使用的是一个单一卡洛芬（4.0-5.0毫克/公斤，皮下注射）围手术期管理。对于不同的镇痛协议，看到Hellebrekers等人 7 。
- 清洁剃光面积的T他从中央到三次用消毒剂（如洗必泰0.5％）和本地注入利多卡因（20毫克/毫升）和肾上腺素（5毫克/毫升）的混合物，用于局部麻醉和血管收缩（防止头发外围的皮肤出血过多）。
- 作出约2.5厘米的头皮中线前后的切口，直到耳朵后面的眼睛之间。使用4-6猛犬夹捏皮肤，保持切口开放。取出压舌板和/或棉签和清洁的面积暴露颅骨表面有任何结膜组织。
- 检查头部水平：第一，找到的Lambda和引导套管的地方正好在这个位置，触及颅骨。记录背腹的坐标。下一步，将完全超过前囟引导插管，感人的头骨，并记录其背腹坐标。这两个坐标应该是相同的的。如果差值大于0.3毫米，调整鼻栏加以纠正。
- 中号AKE两个小孔用于固定颅骨螺钉，使用消毒手钻（约5毫米的前一个半球的套管位置和其他5毫米，后在对侧半球的套管位置）。放置这些孔的两成无菌螺丝，直到他们没有被完全插入到头骨，紧紧地锚。
- 随着引导导管置于前囟完全，记录前后和横向坐标。添加或减去从囟一个立体图集9-11援助，可以计算出每个大脑区域指导导管放置正确的位置。
- 位置在其正确的位置引导套管，略微触及颅骨。记录背腹的坐标。对于双边插管的位置，找到未来在另一个半球的套管位置，并再次背腹坐标。两个坐标应该是相同的的（或不同<0.3毫米）。
- 用无菌铅笔标记头骨上的套管位置，手钻，颅骨钻孔，检查指导导管援助的规模和正确的位置。一旦孔，使用消毒针头轻轻一拳脑膜允许通畅的导管插入。
- 第一洞放入套管和仔细降低，直到达到最终的腹协调。准备牙科水泥和慷慨申请周围的套管和一个或两个螺丝以固定的套管。等待，直到完全干燥的水泥。之后，小心地取出的背腹杆向上转动套管支持。
- 放置到支持第二套管和套管在另一个半球的位置去。套管成孔，并重复上一步。盖上的螺丝和一个大型水面的套管与水泥，水泥之前是干的，从皮肤移除任何剩余。
- 注入温水（〜37℃）无菌生理盐水（〜10毫升/公斤，SC），以确保补液。
- 水泥已经完全干涸后，取出套管支持，并放入无菌针，每一个套管，以防止阻塞。
- 用无菌生理盐水清洗伤口面积，正面和背部的伤口缝合。
- 从立体定位仪上删除的动物，在它的鼻子前更换气管。继续监测血氧饱和度水平和体温。
- 如果与右美托咪啶注射麻醉剂，注入其拮抗剂atipamezole（0.25毫克/千克，SC），并等待，直到动物唤醒（约5分钟）。
- 大鼠放入一个回收笼。为了避免低温，笼放置在孵化器在28 ° C或加热垫在一个地方，你可以观察到至少有一个小时的动物，在返回之前vivarium室。
3。手术后的护理
- 在手术后第4天，监测老鼠的复苏，保持每日记录的重量和其他有关的动物在实验室记录簿或“动物福利日记”条件的意见。
- 动物疾病，感染的伤口，体重损失或减少福祉必须接受特殊照顾的其他迹象显示明显的迹象：如额外的止痛药剂量，以尽量减少手术后的疼痛，粉的食物和水的混合物除了标准州城刺激老鼠的食欲，和/或皮下注射生理盐水支持补液。
- 如果老鼠没有显示出任何改善这些干预措施后，或身体消瘦是> 15％（比手术前体重），牺牲动物麻醉剂过量（人道终点）。
- 大鼠通常需要至少7天的行为实验开始前恢复。
4。代表性的成果
jove_content“>确定是否的各种修改我们的手术过程，特别是氧气补充和连续监测血液氧合水平，心率和体温，，增强动物的生存和提高，手术后其一般条件下，我们比较了非生存率高达20动物（包括20只大鼠）接受手术治疗后，我们实施了这些修改与非生存率与标准协议经营的24个同伙（各20只大鼠）。同伙如图1a所示，非生存率显着降低，与修改后的协议（P <0.05，采用Mann - Whitney U检验，两尾）经营的同伙的样本。此外，由于在图1b显示，减肥手术后手术组大鼠与修改后的协议也显著减少相比，大鼠，操作的标准程序（手术后第1天：P <0.05手术后第2天：P <0.01;手术后第3天：P = 0.17;学生t -检验）
图1非成活率和手术后的减肥手术的修改的影响。 （A）非生存率手术组大鼠与修改后的协议作为标准协议与手术组大鼠相比。非存活率（中位数±四分位范围）大鼠的百分比计算，每20只大鼠的队列，没有生存的手术。 * P <0.05，采用Mann - Whitney U检验两个尾（N = 20修改后的协议和标准协议24同伙同伙） 。 （B）减肥（POD1）第一，第二（POD2）和第三（POD3）手术后一天期间（平均± SEM）作为手术前重量的百分比。 * P <0.05，** P <0.01，学生t检验（N = 60）每组。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这个视频演示的主要目的是熟悉立体定向手术的基本原则的行为神经学家。研究人员已经进行立体定向手术，也可能从这个视频中受益，并考虑在自己的实验室中使用的一些程序上的修改。约1-3优化外科技术的不断增加知识，发展新的麻醉剂和止痛剂的使用在人用和兽用医药4,12，公众意识的动物福利问题，并严格的立法（例如，在2010年欧盟指令实验动物的使用 5）促使我们实施新的程序，补充氧气和手术过程中的血氧和心率水平的连续监测。我们观察到，作为一个有代表性的动物样本，整体提高成活率和显著减少手术后的减肥所示。这种减少手术后的重量损失可能反映动物的手术更小的负担，因此，结果在一个更活跃的动物，在手术后立即的。是否也有其长期的健康有益的影响，目前尚不清楚。然而，一个显着的观察，暂时卸下氧气供应，在血氧饱和度水平的显着和可靠的减少，这可能会下降，甚至低于50％（见视频演示，为示范本）。可以想象的是长期的氧气不足的血药浓度，可能发生在手术过程中没有提供任何补充氧气的动物，可能会导致缺氧长期的行为后果，也带来负面影响行为实验的结果和/或质量。我们不知道是否这样的手术过程中氧气的血液供应的抑郁症是具体到我们的实验室中使用的麻醉协议（即一种ketami混合物NE和右旋美托咪啶），或者是否是一个较为普遍的现象，注射麻醉药。使用吸入麻醉，环境空气和氧气的混合物，可能是另一种方法来克服抑郁症血液中的氧含量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢彼得Gerrits博士在视频中使用的图纸。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
