Deteksjon og Isolering av Sirkulerende Melanom Cells bruke photoacoustic Flowmetry

Summary

Vi har utviklet et flowcytometer bruker laser indusert ultralyd til å påvise sirkulerende melanoma celler som en tidlig indikator på metastatisk sykdom.

Abstract

Sirkulerende tumorceller (CTCs) er de cellene som har skilt fra en makroskopisk tumor og spres gjennom blod og lymfe-systemer til frø sekundære svulster ^1,2,3. CTCs er indikatorer av metastatisk sykdom og deres oppdagelse i blodprøver kan brukes til å diagnostisere kreft og overvåke pasientens respons på behandlingen. Siden CTCs er sjeldne, bestående om en svulst celle blant milliarder av normale blodceller i avanserte kreftpasienter, deres påvisning og telling er en vanskelig oppgave. Vi utnytter tilstedeværelsen av pigment i de fleste melanom cellene til å generere photoacoustic, eller laser indusert ultrasoniske bølger i en egendefinert flowcytometer for påvisning av sirkulerende melanom celler (CMCs) ^4,5. Denne prosessen innebærer å skille en fullblodsprøve bruker sentrifugering og innhenting av hvite blodlegemer lag. Hvis stede i fullblod, vil CMCs skille med de hvite blodcellene grunn til lignende tetthet. Disse cellene er resuspendert ifosfatbufret saltvann (PBS) og introdusert i strømningsmåleren. Snarere enn en kontinuerlig strøm av blod cellesuspensjonen, induserte vi to fase strøm for å fange opp disse cellene for videre studier. I to fase strøm, to blandbare væsker i en microfluidic system møtes på et knutepunkt og danne vekslende slugs av flytende ^6,7. PBS suspendert hvite blodlegemer og luft danner mikroliter slugs som er sekvensielt bestrålt med laserlys. Tillegg av en surfactant til væskefasen lar uniform slug formasjon og brukeren kan opprette forskjellige størrelser slugger ved å endre forbruk av de to fasene. Snegler av luft og snegler av PBS med hvite blodceller inneholder ingen lys absorbenter og dermed ikke produserer photoacoustic bølger. Men slugs av hvite blodceller som inneholder enda enkelt CMCs absorbere laserlys og produserer høyfrekvente akustiske bølger. Disse snegler som genererer photoacoustic bølger er isolert og samlet for cytochemical farging for verificasjon av CMCs.

Protocol

1. Blood prøveopparbeidelse

1. Tegn ca 10 ml fullblod fra en Stage IV kreftpasient i to 5 mL vacutainers.
2. Sentrifuger rørene i ti minutter ved 3000 omdreininger per minutt (rpm).
3. Blodprøven vil skille i tre forskjellige lag: det nederste laget består av erytrocytter, det midterste laget, også kalt Buffy Coat, inneholder leukocytter og melanom celler, og det øverste laget inneholder plasma og blodplater. Fjern så mye plasma som mulig uten å forstyrre Buffy Coat.
4. Plasser 250 mL av Histopaque 1077 i to 1 mL Wintrobe rør.
5. Ved hjelp av en 9 "Pasteur pipette, trekke de resterende plasma, hele Buffy Coat, og selv det øverste laget av erytrocytter, og pass på å samle <500 mL.
6. Plasser løsningen på toppen av Histopaque laget og Sentrifuger Wintrobe rørene i 15 ml koniske rør i 10 minutter ved 3000 rpm.
7. Blodet vil igjenseparate, men denne gangen erytrocytter vil bli atskilt av Histopaque, muliggjør enkel ekstraksjon av Buffy Coat. Bruk en 9 "Pasteur pipette å få hele Buffy Coat og legg den i en 2 mL Eppendorf rør.
8. Suspendere Buffy Coat i 1,5 mL PBS med 2% v / v Tween 20.

2. Flow Chamber Konstruksjon

1. Motta akryl sylinder, 20 mm ytre diameter, 17 mm indre diameter og 8 mm høy. Bor tre 5 mm diameter hull gjennom siden av sylinderen på 90 graders vinkler fra hverandre. Skjær tre stykker av polymer tubing (1,6 mm innvendig diameter, 5 mm ytre diameter), og plassere dem inn i hullene.
2. Strekk Parafilm over bunnen av akryl ringen for å gjøre en vanntett forsegling. Den Parafilm danner en grunn bolle med akryl ringen, og vil holde akrylamid løsning som vil danne en flyt chamber.
3. Suspendere en 1,6 mm diameter ledning gjennom deler av slangen som er på tvers avhverandre, og pass på at ledningen alene er synlig gjennom midten av ringen. Fyll den tredje stykke rør med en 1,6 mm diameter wire og posisjon røret 1 mm unna suspendert ledningen. Disse ledningene hindrer akrylamid kommer inn i slangen. Etter akrylamid stivner, ledningene vil bli trukket ut, og etterlater en sylindrisk strømningsbanen og et sted å plassere en optisk fiber fokuserer på strømningsbanen.
4. Tilsett 5 ml forberedt akrylamid [20 g akrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 mL destillert vann] til et lite begerglass. Mål opp 0,02 g ammonium persulfate (Sigma) og legge den til begerglasset. Bland med en bevegelse bar i 3 minutter. Tilsett 20 mL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) til begerglasset. Raskt hell røren i akryl ringen, fylle til toppen. Etter noen sekunder vil løsningen gel, gjør en flyt chamber mold. Trekk ledningene ut, og pass på ikke å forstyrre akrylamid gel. Flyten ChamBER er nå klar til bruk.

3. Photoacoustic flowmetry set-up

1. Akustisk par en polyvinylidene fluor piezoelektrisk akustisk svinger (Panametrics) til en flyt kammer ved hjelp av ultralyd gel direkte over strømningsbanen.
2. Ved hjelp av en Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabel, kobler svingeren til inngangen på en RITEC Broadband Receiver-640A (Lavpassfilter: ut, highpass filter: 1 MHz, imput impedans: 50 ohm, forsterkning: 35 dB). Koble utgangen av filteret til oscilloskop (Tektronix TDS 2024B). For å utløse oscilloskop, er en fotodiode (Thorlabs) satt opp i nærheten svingeren og er koblet til oscilloskopet med en BNC-kabel.
3. En t-kontakt (Small Parts) er festet til en arm av flyten kammeret. To sprøyte pumper (Braintree Scientific) er koblet til den andre grener av kontakten. En sprøyte inneholder luft, mens den andre vil inneholde cellesuspensjonen utarbeidet i del 1. Sett flow priser til100 mL / minutt.
4. Pakk den lille slangen på flyten kammeret til en liten lomme av luft former, og sett en 1 mm diameter kjerne optisk fiber med en 0,37 numerisk apertur i det sporet. Fyll lommen med vann for å redusere grensesnitt signaler og øke mengden av laserlys brukes til strømningsbanen. På grunn av den numerisk apertur av optiske fiber og kort avstand til strømningsbanen, vil laseren bare strålebehandling en slug av prøven til enhver tid, slik at prøven rett foran laseren er den samme prøven skape photoacoustic signaler. Laseren energi bør være ca 28 mJ / cm ² med litt størrelse på 7 mm ^2.
5. Slå både sprøyte pumper på. Når de to blandbare væsker nå t-krysset de vil bli partisjonert i homogen snegler og flyt forbi svingeren.
6. Strålebehandling den strømmende prøven med et nanosekund pulset laser for å generere photoacoustic bølger i melanom cellene. Ettersom melanin er en broadbog optisk absorber, kan noen synlige laser bølgelengde brukes.
7. Hvis et signal vises på oscilloskopet når en slug er på toppen av svinger, inneholder slug melanom, og kan spores gjennom systemet til å slippe inn en samling hetteglass.

Fire. Immunocytochemistry

1. Ta fanget sneglene til en Cytospin 4 Sentrifuger (Thermo Scientific) for å fikse dem til glass lysbilder. Plasser glass glir inn Cytofunnels (Shandon EZ Enkel Cytofunnel med Brown Filter kort Thermo Scientific) og laste dem inn i Cytospin 4 Centrifuge. Sett 100 mL av 1% Bovine serum albumin (Sigma) i PBS i hver trakt og så sentrifuger ved 600 rpm i 3 minutter for å hjelpe fanget cellene holde seg til glasset lysbilder.
2. Etter sentrifugering, legger celleprøver til Cytofunnels og sentrifuger ved 600 rpm i 3 minutter. Så spray lysbildene med en etanol basert fiksativ.
3. Vask lysbildene i PBS i 10 minutter to ganger.
4. Etter inkubering, dekanter lysbilder og inkuber med den primære antistoffet løsningen for 1 time i en fuktet kammer ved romtemperatur. Hver side skal inneholde 1% MART-1 antistoff oppvokst i kanin, 1% CD-45-antistoff oppvokst i mus, 10% Goat serum, og 89% PBS.
5. Etter inkubasjon, vask lysbildene i PBS i 10 minutter tre ganger.
6. Lysbildene blir deretter inkubert i en sekundær antistoff løsning, som har fluoroforen bundet til antistoffer. Blandingen inneholder 0,05% geit anti-kanin antistoff, 0,05% geit anti-mus antistoff, 0,1% geit serum, og 99% PBS. Lysbildene inkuberes i mørke i en time ved romtemperatur.
7. Etter inkubasjon dekanter lysbildene vask i PBS i 5 minutter tre ganger.
8. Å farge for en kjerne, Inkuber cellene med 0,1 mikrogram / mL DAPI (Invitrogen) for1 minutt. Så dekanter lysbilder og vask i PBS.
9. Montere et dekkglass over celleprøve bruker 20 mL av en harpiks-basert montering media per lysbilde. Tett dekkglass med klar neglelakk for å bevare lysbildet. Nå lysbildene er klar til å bli fotografert med et fluorescerende mikroskop.

5. Representant Resultater:

Figur 1. Den photoacoustic bølgeformer fra hvite blodceller og melanom celler er vist her. De hvite blodcellene, har ingen iboende pigmentering, produserer ingen photoacoustic bølger og manifest som en flat linje av elektronisk støy (til venstre). Den pigmenterte melanom cellene produserer et robust photoacoustic bølge (høyre).

Figur 2. Etter immunocytochemical flekker, cultured melanom celler show DAPI signaler i blue mens MART1 er uthevet i grønt.

Figur 3. Overliggende bilder for DAPI og MART1, som i figur 2, med CD45 som en indikator på leukocytter, viser dette tallet melanom celler blant flere hvite blodlegemer.

Discussion

Oppdage CTCs er fortsatt et forsknings-intensive felt med svært få kliniske applikasjoner på grunn av vanskelige problemet med å isolere de sjeldne kreftceller. Mange andre teknikker blir evaluert for CTC deteksjon, inkludert RT-PCR, microfluidic celle fangst, immunomagnetiske fangst, og andre metoder ^8-12. Men photoacoustic deteksjon av CMCs viser løfte som det er etiketten gratis og gir en rask og nøyaktig måte å fange små, lette å absorbere partikler.

Protokollen er beskrevet å isolere hvite blodlegemer er svært effektiv, men likevel et lavt antall røde blodceller finnes i prøven. Disse rouge forurensende cellene også absorbere laserlys, men på et sterkt redusert nivå. For å sikre de røde blodcellene ikke forstyrre våre melanom detection system ble fem sunne pasientprøver introdusert gjennom systemet, og ingen ga et signal, som indikerer at røde blod celler er til stede ved lave nok konsentrasjoner til åses bort fra.

En rekke konsentrasjon studier har vært utført med dyrkede melanom celler og photoacoustic flow system har vist seg sensitiv ned til en celle / mL (upubliserte data). Disse studiene er på gang og snart vil omfatte forsøk med kreft pasientprøver.

Dette photoacoustic teknikken blir også evaluert for bruk i ikke-pigmenterte CTCs, som brystkreft og prostatakreft ved å feste eksogene chromophores. Vi har utført forberedende arbeid med gull nanopartikler på kreft cells13. Disse testene har vist at nanopartikler kan gi den nødvendige optiske absorpsjon å generere photoacoustic bølger. De resterende tekniske utfordringen er å knytte slike partikler til kreftceller selektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234