Upptäckt och isolering av cirkulerande melanomceller med photoacoustic Flowmetry

Summary

Vi har utvecklat en flödescytometer med laser inducerad ultraljud för att upptäcka cirkulerande melanom celler som en tidig indikator på metastaserad sjukdom.

Abstract

Cirkulerande tumörceller (CTCS) är de celler som har separerade från en makroskopisk tumör och sprids genom blod och lymfa system till utsäde sekundära tumörer ^1,2,3. CTCS är indikatorer på metastaserad sjukdom och deras upptäckt i blodprov kan användas för att diagnostisera cancer och övervaka en patients svar på behandlingen. Eftersom CTCS är sällsynta, omfattar ca en tumör cell bland miljarder av normala blodkroppar i framskriden cancer patienter, deras upptäckt och kvantifiering är en svår uppgift. Vi utnyttjar närvaron av pigment i de flesta melanom celler för att generera photoacoustic, eller laser inducerad ultraljudsvågor i en anpassad flödescytometer för detektion av cirkulerande melanom celler (CMCs) ^4,5. Denna process innebär att separera ett helblodsprov med centrifugering och få det vita lagret blodkroppar. Om det finns i blod, kommer CMCs separera med de vita blodkroppar på grund av liknande densitet. Dessa celler är suspenderade ifosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förs in flödesmätaren. I stället för ett kontinuerligt flöde av blod cellsuspensionen framkallade vi två fas flöde för att fånga dessa celler för vidare studier. I två fas flöde, två icke blandbara vätskor i en mikroflödessystem träffas i en korsning och bildar alternerande sniglar av flytande ^6,7. PBS svävande vita blodkroppar och luft bildar sniglar mikroliter som sekventiellt bestrålas med laserljus. Tillägget av ett ytaktivt till vätskefasen låter enhetlig proppbildning och användaren kan skapa olika stora sniglar genom att ändra flöden de två faserna. Sniglar av luft och sniglar i PBS med vita blodkroppar innehåller inga ljus absorbenter och därmed inte ger photoacoustic vågor. Men sniglar av vita blodkroppar som innehåller ens enda CMCs absorberar laserljuset och producera höga vågor frekvens akustiska. Dessa sniglar som genererar photoacoustic vågor är binds och samlas in för cytochemical färgning för verificring av CMCs.

Protocol

1. Blod provberedning

1. Rita ca 10 ml helblod från en steg IV cancerpatient i två 5 ml vacutainers.
2. Centrifugera rören i tio minuter vid 3000 varv per minut (rpm).
3. Blodprovet kommer att dela upp i tre olika skikt: nedre skiktet består av röda blodkroppar, mellersta lagret, även kallad buffy coat, innehåller leukocyter och celler melanom, och det översta lagret innehåller plasma och trombocyter. Ta bort så mycket plasma som möjligt utan att störa buffy coat.
4. Plats 250 mikroliter av Histopaque 1077 i två 1 ml Wintrobe rör.
5. Med hjälp av en 9 "pasteurpipett, extrahera återstående plasma hela buffy coat, och även det översta lagret av röda blodkroppar, och se till att samla in <500 mikroliter.
6. Placera lösningen atop Histopaque lagret och centrifugera Wintrobe rören i 15 ml koniska rör i 10 minuter vid 3000 rpm.
7. Blodet kommer återseparata, men den här gången erytrocyter kommer att separeras från Histopaque, vilket möjliggör enkel utvinning av buffy coat. Använd en 9 "pasteurpipett att få hela buffy coat och placera den i en 2 ml Eppendorf-rör.
8. Häng buffy coat i 1,5 mL PBS med 2% v / v Tween 20.

2. Flöde avdelningen Bygg

1. Skaffa en akryl cylinder, 20 mm ytterdiameter, 17 mm innerdiameter, och 8 mm hög. Borra tre 5 mm diameter hål i sidan av cylindern i 90 graders vinkel från varandra. Klipp tre stycken av polymera slang (1,6 mm innerdiameter, 5 mm ytterdiameter), och placera dem i de borrade hålen.
2. Sträck Parafilm över botten av akryl ringen för att göra en vattentät försegling. Den parafilm bildar en grund skål med akryl ringen och kommer att hålla akrylamid lösning som kommer att utgöra ett flöde kammare.
3. Avstänga en 1,6 tråd mm diameter genom bitar av slangen som är mittemotvarandra och se till att kabeln bara är synlig genom mitten av ringen. Fyll den tredje slang med en 1,6 mm tråd och placera rör 1 mm från suspenderade tråd. Dessa ledare hindrar akrylamid från att komma in i slangen. Efter akrylamid stelnar, ledningarna kommer att utvinnas, vilket ger en cylindrisk flödesväg och en plats att placera en optisk fiber fokuserar på flödet väg.
4. Tillsätt 5 ml beredd akrylamid [20 g akrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml destillerat vatten] till en liten bägare. Mät upp 0,02 g ammoniumacetat persulfate (Sigma) och lägga till det i bägaren. Blanda med en omrörare i 3 minuter. Tillsätt 20 mikroliter tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) till bägaren. Snabbt häll blandningen i akryl ringen, fyllning till toppen. Efter några sekunder kommer lösningen gel, gör en mögel flöde kammare. Dra försiktigt ledningarna ut, se till att inte störa akrylamid gelen. Flödet ChamBER är nu klar för användning.

3. Photoacoustic flowmetry set-up

1. Akustiskt par en polyvinylidenfluorid piezoelektrisk akustiska givare (Panametrics) till ett flöde kammare med hjälp av ultraljud gel direkt ovanför flödesväg.
2. Med hjälp av en bajonettfattning Neill-Concelman (BNC) kabel, anslut givaren till ingången på en RITEC bredband mottagare-640A (lågpassfilter: ut, högpass filter: 1 MHz, imput impedans: 50 Ohm, förstärkning: 35 dB). Anslut utgången av filtret till oscilloskopet (Tektronix TDS 2024B). Att trigga oscilloskopet är en fotodiod (Thorlabs), som inrättats nära givaren och ansluts till oscilloskopet med en BNC-kabel.
3. En T-kontakt (små delar) är ansluten till en gren av flödet kammaren. Två spruta pumpar (Braintree vetenskapliga) är anslutna till andra grenar av kontakten. En spruta innehåller luft, medan den andra kommer att innehålla cellsuspensionen upprättats i del 1. Ställ in flöde till100 ml / minut.
4. Extrahera den lilla rör av flödet kammaren tills en liten ficka av luft former, och sätt en 1 mm diameter kärna optisk fiber med en 0,37 numeriska bländaröppningen i kortplatsen. Fyll fickan med vatten för att minska gränssnitt signaler och öka mängden laserljus tillämpas på flödesväg. På grund av den numeriska bländaröppningen av optisk fiber och kort avstånd till flödesbanan kommer lasern bestråla enda snigel av provet vid varje given tidpunkt, se till att provet direkt framför lasern är samma prov skapa photoacoustic signaler. Lasern energi bör cirka 28 mJ / cm ² med lite storlek på 7 mm ^2.
5. Vrid båda spruta pumpar på. När de två icke blandbara vätskor når T-korsningen kommer de att delas upp i homogena sniglar och flöde förbi givaren.
6. Bestråla den strömmande provet med en nanosekund pulsad laser för att generera photoacoustic vågor i melanom celler. Eftersom melanin är en broadboch optiska absorbatorn kan någon synlig laser våglängd användas.
7. Om en signal visas på oscilloskopet när en snigel är på toppen av givaren innehåller snigel melanom och bör följas upp genom systemet tills släppa in en samling flaska.

4. Immuncytokemi

1. Ta fångade sniglar till en Cytospin 4 Centrifug (Thermo Scientific) för att fixa dem till glas bilder. Placera glaset glider in Cytofunnels (Shandon EZ Single Cytofunnel med brunt filter Card Thermo Scientific) och ladda in dem i Cytospin 4 Centrifug. Sätt 100 mikroliter 1% bovint serumalbumin (Sigma) i PBS i varje tratt och sedan centrifugera vid 600 rpm i 3 minuter för att hjälpa den tagna cellerna fastnar på glaset bilder.
2. Efter centrifugering, lägg till cellprover till Cytofunnels och sedan centrifugera vid 600 rpm i 3 minuter. Spraya sedan bilderna med en etanol baserad fixativ.
3. Tvätta objektglasen i PBS i 10 minuter två gånger.
4. Efter inkubation, dekantera diabilder och inkubera med den primära antikroppen lösningen för en timme i en fuktig kammare vid rumstemperatur. Varje sida ska innehålla 1% Mart-1 antikroppar upp i kanin, 1% CD-45 antikropp upp i mus, 10% get serum, och 89% PBS.
5. Efter inkubation, tvätta objektglasen i PBS i 10 minuter tre gånger.
6. Bilderna inkuberas därefter i en sekundär antikropp lösning som fluoroforen har bundit till antikropparna. Blandningen innehåller 0,05% get anti-kanin-antikroppar, 0,05% get anti-mus antikropp, 0,1% get serum, och 99% PBS. Bilderna inkuberas i mörker under 1 timme i rumstemperatur.
7. Efter inkubation och häll över bilderna tvätt i PBS i 5 minuter tre gånger.
8. Färgen verka under en kärna, Inkubera cellerna med 0,1 mikrogram / ml DAPI (Invitrogen) för1 minut. Sedan dekantera bilderna och tvätta i PBS.
9. Montera ett täckglas över cellen provet med hjälp av 20 mikroliter av en hartsbaserade montering medier per bild. Täta täckglas med tydliga nagellack för att bevara bilden. Nu är bilderna är redo att avbildas med en fluorescerande mikroskop.

5. Representativa resultat:

Figur 1. Photoacoustic vågformer från vita blodkroppar och celler melanom visas här. De vita blodkropparna, som inte har någon inneboende pigmentering, ger inga photoacoustic vågor och visar sig som en platt linje av elektroniskt brus (vänster). Det pigmenterade melanom celler producerar en robust photoacoustic våg (till höger).

Figur 2. Efter immuncytokemiska färgning, odlade melanomceller visa DAPI signaler i blUE medan MART1 är markerad i grönt.

Figur 3. Överlagra bilder för DAPI och MART1, som i figur 2, med CD45 som en indikator på leukocyter, visar denna siffra melanomceller bland flera vita blodkroppar.

Discussion

Upptäcka CTCS är fortfarande ett forskningsintensivt område med mycket få kliniska tillämpningar på grund av det svåra problemet att isolera den sällsynta tumörceller. Många andra tekniker håller på att utvärderas för CTC detektering, inklusive RT-PCR, mikroflödessystem cell fånga, immunomagnetic fånga, och andra metoder ^8-12. Men photoacoustic upptäckt av CMCs visar löfte som det är etikett gratis och ger en snabb och korrekt sätt för att fånga små, ljusabsorberande partiklar.

Protokollet beskrivs att isolera vita blodkroppar är mycket effektiv, men ändå ett lågt antal röda blodkroppar finns i provet. Dessa rouge förorena celler absorberar också laserljus, men på en kraftigt minskad nivå. För att säkerställa de röda blodkropparna inte stör vårt melanom detektionssystem har fem friska patientprover infördes genom systemet och ingen gav en signal som indikerar att röda blodkroppar är närvarande vid tillräckligt låg koncentrationerlämnas utan avseende.

En rad koncentration studier har genomförts med hjälp av odlade melanom celler och photoacoustic flödet systemet har visat känslig ner till en cell / mikroliter (opublicerade data). Dessa studier är på väg och kommer snart att inkludera studier med prover cancerpatient.

Detta photoacoustic teknik utvärderas också för användning i icke-pigmenterade CTCS, såsom bröst-och prostatacancer genom att lägga exogena kromoforer. Vi har utfört förberedande arbete med hjälp av guld nanopartiklar om cancer cells13. Dessa tester har visat att nanopartiklar kan ge den nödvändiga optisk absorption för att generera photoacoustic vågor. De återstående tekniska utmaningen är att fästa sådana partiklar till cancerceller selektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234