Påvisning og isolation af cirkulerende melanom celler ved hjælp af Photoacoustic Flowmetry

Summary

Vi har udviklet et flowcytometer ved hjælp af laser induceret ultralyd til at påvise cirkulerende melanom celler som en tidlig indikator for metastatisk sygdom.

Abstract

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er de celler, der er adskilt fra en makroskopisk tumor og spredes gennem blod og lymfe-systemer til frø sekundære tumorer ^1,2,3. CTCs er indikatorer for metastatisk sygdom og deres detektion i blodprøver kan bruges til at diagnosticere kræft og overvåge en patients respons på behandlingen. Siden CTCs er sjældne, bestående af omkring en tumor celle blandt milliarder af normale blodlegemer i fremskreden cancer patienter, deres påvisning og tælling er en vanskelig opgave. Vi udnytter tilstedeværelsen af pigment i de fleste melanom celler til at generere Photoacoustic, eller laser induceret ultralyd bølger i en brugerdefineret flowcytometer til påvisning af cirkulerende melanom celler (CMCs) ^4,5. Denne proces indebærer adskillelse af en fuldblodsprøve med centrifugering og få de hvide blodlegemer lag. Hvis den nuværende i fuldblod, vil CMCs Adskil med de hvide blodlegemer på grund af tilsvarende tæthed. Disse celler er resuspenderet ifosfatbufferet saltopløsning (PBS) og indført i flowmåleren. I stedet for en kontinuerlig strøm af blod cellesuspensionen, vi induceret to fase flow med henblik på at indfange disse celler til videre undersøgelse. I to fase flow, opfylde to blandbare væsker i en mikrofluid system på et vejkryds og form vekslende sneglene af flydende ^6,7. PBS suspenderet hvide blodlegemer og luft danner mikroliter snegle, der er sekventielt bestrålet med laserlys. Tilføjelsen af ​​et overfladeaktivt stof til den flydende fase giver en ensartet slug dannelse, og brugeren kan oprette forskellige størrelse snegle ved at ændre flow af de to faser. Snegle af luft og sneglene af PBS med hvide blodlegemer indeholder ingen lys absorbere og dermed ikke producerer Photoacoustic bølger. Men snegle af hvide blodlegemer, der indeholder endda en enkelt CMCs absorberer laserlys og producerer højfrekvente akustiske bølger. Disse snegle, der genererer Photoacoustic bølgerne er afsondret og indsamles til cytochemical farvning for verifiction af CMCs.

Protocol

1. Blood prøveforberedelse

1. Tegn cirka 10 ml fuldblod fra en Stage IV kræftpatient i to 5 ml vacutainers.
2. Centrifuger rørene i ti minutter ved 3.000 omdrejninger i minuttet (rpm).
3. Blodprøven vil adskille i tre forskellige lag: det nederste lag består af erytrocytter, det midterste lag, også kaldet buffy coat, indeholder leukocytter og melanom celler, og det øverste lag indeholder plasma og blodplader. Fjern så meget plasma som muligt uden at forstyrre buffy coat.
4. Placer 250 μL af Histopaque 1077 i to 1 ml Wintrobe rør.
5. Ved hjælp af en 9 "Pasteur-pipette, de resterende plasma, hele buffy coat, og selv det øverste lag af erythrocytter ekstrakt, og sørg for at indsamle <500 μL.
6. Placer en løsning på toppen af ​​Histopaque lag og centrifuger Wintrobe rørene i 15 mL koniske rør i 10 minutter ved 3000 rpm.
7. Blodet vil igenseparat, men denne gang erytrocytterne vil blive udskilt af Histopaque, der giver nem ekstraktion af buffy coat. Brug en 9 "Pasteur-pipette for at få hele buffy coat og læg den i en 2 ml eppendorfrør.
8. Hæng buffy coat i 1,5 ml PBS med 2% v / v Tween 20.

2. Flow Afdeling Byggeri

1. Få en akryl cylinder, 20 mm ydre diameter, 17 mm indvendig diameter og 8 mm høj. Bor tre 5 mm huller gennem siden af ​​cylinderen på 90 graders vinkler fra hinanden. Skær tre stykker af polymer slange (1,6 mm indre diameter, 5 mm ydre diameter), og placer dem i de borede huller.
2. Stræk Parafilm hen over bunden af ​​akryl ringen for at lave en vandtæt forsegling. Den parafilm danner en flad skål med akryl ring og vil holde acrylamid løsning, der vil danne et flow kammer.
3. Suspendere en 1,6 mm diameter wiren gennem stykker af slanger, der er på tværs frahinanden, og sørg for, at wiren alene er synligt gennem midten af ​​ringen. Fyld den tredje stykke slange med en 1,6 mm tråd og placer røret 1 mm væk fra den suspenderede ledning. Disse wirer forhindrer akrylamid ind i slangen. Efter akrylamid størkner, ledningerne vil blive udtrukket, hvilket efterlader et cylindrisk flow sti og et sted at placere en optisk fiber fokuserer på flow vej.
4. Der tilsættes 5 ml af tilberedt acrylamid [20 g acrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 mL destilleret vand] til et lille bægerglas. Afmål 0,02 g af ammonium persulfat (Sigma), og føje det til bægerglasset. Bland med en røre bar i 3 minutter. Tilsæt 20 μL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) til bægerglasset. Hurtigt hæld blandingen i akryl ring, fylde op til toppen. Efter et par sekunder, vil løsningen gel, gør et flow kammer mug. Træk forsigtigt ledningerne ud, og sørg for ikke at forstyrre acrylamid gel. Strømmen ChamBER er nu klar til brug.

3. Photoacoustic flowmetry set-up

1. Akustisk par en polyvinylidenfluorid piezoelektrisk akustisk transducer (Panametrics) til et flow kammer ved hjælp af ultralyd gel direkte over strømningsbane.
2. Ved hjælp af en Bajonet Neill-Concelman (BNC) kabel, tilslut transduceren til indgangen på en RITEC Bredbånd Receiver-640A (lavpasfilter: ud, Highpass filter: 1 MHz, imput impedans: 50 ohm, forstærkning: 35 dB). Forbind udgangen af ​​filteret til oscilloskopet (Tektronix TDS 2024B). For at udløse oscilloskop, er en fotodiode (Thorlabs), der er oppe i nærheden af ​​transduceren og er sat i oscilloskopet ved hjælp af et BNC-kabel.
3. En t-stik (Small Parts) er knyttet til den ene arm af flowet kammeret. To sprøjtepumper (Braintree videnskabelige) er forbundet til andre grene af stikket. En sprøjte indeholder luft, mens den anden vil indeholde cellesuspensionen udarbejdet i del 1. Indstil flow satser på100 μL / minut.
4. Uddrag den lille slange af flowet kammeret, indtil en lille lomme af luft former, og indsæt en 1 mm i diameter core optisk fiber med en 0,37 numeriske åbning i den pågældende slot. Fyld lommen med vand for at mindske grænsefladen signaler og øge mængden af ​​laserlys anvendes på strømningsbane. På grund af den numeriske åbning af de optiske fibre og korte afstand til flow vej, vil laseren kun bestråle en skovsnegl af prøve på et givent tidspunkt, hvilket sikrer, at prøven direkte foran laseren er den samme prøve at skabe Photoacoustic signaler. Laseren energi bør være omkring 28 mJ / cm ² med en spot størrelse på 7 mm ^2.
5. Drej begge sprøjtepumper på. Da de to ikke-blandbare væsker nå T-krydset vil de blive delt i homogene snegle og flow forbi transduceren.
6. Bestråle det strømmende prøven med et nanosekund pulserende laser til at generere Photoacoustic bølger i melanom celler. Som melanin er en broadbog optiske absorber, kan enhver synlige laser bølgelængde anvendes.
7. Hvis et signal vises på oscilloskopet, når en skovsnegl er på toppen transduceren, The Slug indeholder melanom, og vil kunne spores gennem systemet, indtil slippe ind i en samling hætteglas.

4. Immuncytokemi

1. Tag fanget snegle til en Cytospin 4 Centrifuge (Thermo Scientific) for at rette dem til glas lysbilleder. Anbring objektglas i Cytofunnels (Shandon EZ Single Cytofunnel med Brown Filter Card Thermo Scientific) og indsætte dem i den Cytospin 4 Centrifuge. Put 100 μL på 1% bovint serumalbumin (Sigma) i PBS i hvert tragt og derefter centrifugeres ved 600 rpm i 3 minutter for at hjælpe de erobrede celler holde sig til objektglas.
2. Efter centrifugering, tilføje celleprøver til Cytofunnels og derefter centrifugeres ved 600 rpm i 3 minutter. Så spray dias med en ethanol baseret fiksativ.
3. Vask objektglassene i PBS i 10 minutter to gange.
4. Efter inkubation dekanteres dias og inkuber med det primære antistof løsning for 1 time i et befugtet kammer ved rumtemperatur. Hvert dias skal indeholde 1% MART-1 antistof rejst i kanin, 1% CD-45 antistof rejst i mus, 10% Ged serum, og 89% PBS.
5. Efter inkubation vaskes objektglassene i PBS i 10 minutter tre gange.
6. De slides inkuberes derefter i en sekundær antistof løsning, som har fluoroforen bundet til antistoffer. Blandingen indeholder 0,05% gede anti-kanin antistof, 0,05% ged anti-mus antistof, 0,1% ged serum, og 99% PBS. Objektglassene inkuberes i mørke i 1 time ved stuetemperatur.
7. Efter inkubation dekanteres dias vaskes i PBS i 5 minutter tre gange.
8. For at pletten for en kerne, inkuberes de celler med 0,1 mg / ml af DAPI (Invitrogen) for1 minut. Derefter dekanteres dias og vask i PBS.
9. Montere et dækglas over cellen prøven med 20 μL af en harpiks-baserede montering medier pr dias. Forsegl dækglasset med klar neglelak for at bevare diaset. Nu dias er klar til at blive afbildet med et fluorescerende mikroskop.

5. Repræsentative resultater:

Figur 1. De Photoacoustic waveforms fra hvide blodlegemer og melanom celler er vist her. De hvide blodlegemer, der ikke har nogen iboende pigmentering, producerer ingen Photoacoustic bølger og manifestere sig som en flad linie af elektronisk støj (til venstre). Den pigmenterede melanom celler producerer en robust Photoacoustic bølge (til højre).

Figur 2. Efter immuncytokemiske farvning, viser kulturperler melanom celler DAPI signaler i BLue mens MART1 er fremhævet med grønt.

Figur 3. Overlejring billeder til DAPI og MART1, som i figur 2, med CD45 som en indikator for leukocytter, dette tal viser melanom celler blandt flere hvide blodlegemer.

Discussion

Afsløring CTCs er stadig et forskningsintensive felt med meget få kliniske applikationer på grund af det vanskelige problem med at isolere de sjældne tumorceller. Mange andre teknikker er ved at blive evalueret for CTC påvisning, herunder RT-PCR, microfluidic celle fange, immunomagnetisk fange, og andre metoder ^8-12. Men Photoacoustic påvisning af CMCs viser lovende, da det er label gratis og giver en hurtig og præcis metode til at indfange små, lysabsorberende partikler.

Protokollen beskrev at isolere hvide blodlegemer er yderst effektiv, men alligevel et lavt antal af røde blodlegemer findes i prøven. Disse rouge kontaminerende celler også absorberer laserlys, men på et stærkt reduceret niveau. For at sikre de røde blodlegemer ikke i konflikt med vores melanom detektionssystem, blev fem sunde patientprøver indført gennem systemet, og ingen gav et signal, der angiver, at røde blodlegemer er til stede ved lav nok koncentrationerlades ude af betragtning.

En række af koncentration undersøgelser er blevet udført ved hjælp af kulturperler melanom celler og Photoacoustic flow systemet har vist sig følsomme ned til 1 celle / mikroliter (upublicerede data). Disse undersøgelser er i gang og vil snart omfatte forsøg med kræft patientprøver.

Dette Photoacoustic teknik er også ved at blive evalueret til brug i ikke-pigmenterede CTCs, såsom bryst-og prostatakræft ved at knytte eksogene chromophores. Vi har udført indledende arbejde ved hjælp af guld nanopartikler på kræft cells13. Disse test har vist, at nanopartikler kan give den nødvendige optiske absorption til at generere Photoacoustic bølger. De resterende tekniske udfordring er at sætte sådanne partikler til kræftceller selektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234