Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

Summary

We hebben een flowcytometer met behulp van laser-geïnduceerde echografie op te sporen circulerende melanoom cellen als een vroege indicator van gemetastaseerde ziekte.

Abstract

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn de cellen die zijn gescheiden van een macroscopische tumor en de verspreiding door het bloed en de lymfe systemen om zaad secundaire tumoren ^1,2,3. CTC zijn indicatoren van gemetastaseerde ziekte en hun detectie in bloedmonsters kunnen worden gebruikt om kanker te diagnosticeren en monitoren van een patiënt respons op therapie. Aangezien de CTC zijn zeldzaam, bestaande uit ongeveer een tumorcel te midden van miljarden van normale bloedcellen in gevorderde kankerpatiënten, hun opsporen en kwantificeren is een moeilijke taak. We gebruik maken van de aanwezigheid van pigment in de meeste melanoom cellen te genereren fotoakoestische of laser-geïnduceerde ultrasone golven in een aangepaste flowcytometer voor de detectie van circulerende melanoom cellen (CMC's) ^4,5. Dit proces houdt in het scheiden van een volbloed monster met behulp van centrifugeren en het verkrijgen van de witte bloedcellen laag. Indien aanwezig in volbloed, zal CMC scheiden met de witte bloedcellen als gevolg van soortgelijke dichtheid. Deze cellen worden geresuspendeerd infosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïntroduceerd in de flowmeter. In plaats van een continue stroom van het bloed celsuspensie, we geïnduceerde twee fase stroming in om deze cellen te vast te leggen voor verdere studie. In twee fase stroming, twee niet-mengbare vloeistoffen in een microfluïdische systeem aan op een kruispunt en vormen afgewisseld slakken van vloeibare ^6,7. PBS zwevende witte bloedcellen en de lucht vormen microliter slakken die opeenvolgend worden bestraald met laserlicht. De toevoeging van een oppervlakte-actieve stof van de vloeibare fase laat uniform slug vorming en de gebruiker kan verschillende afmetingen slakken te creëren door het veranderen van het debiet van de twee fasen. Slakken van lucht en naaktslakken van PBS met witte bloedcellen bevatten geen licht absorberen en dus, produceren geen fotoakoestische golven. Echter, naaktslakken van de witte bloedcellen die zelfs enkele CMC's bevatten absorberen laserlicht en produceren hoogfrequente geluidsgolven. Deze slakken die fotoakoestische golven te genereren worden afgezonderd en verzameld voor cytochemische kleuring voor verificatie van CMC's.

Protocol

1. Bloedmonster voorbereiding

1. Trek ongeveer 10 ml volbloed van een Fase IV kankerpatiënt in twee 5 ml vacutainers.
2. Centrifugeer de buizen tien minuten bij 3000 omwentelingen per minuut (rpm).
3. Het bloedmonster wordt gescheiden in drie verschillende lagen: de onderste laag bestaat uit de erytrocyten, de middelste laag, ook wel de buffy coat, bevat leukocyten en melanoom cellen, en de bovenste laag bevat plasma en bloedplaatjes. Verwijder zoveel plasma mogelijk zonder verstoring van de buffy coat.
4. Plaats 250 pi van Histopaque 1077 in twee 1 mL Wintrobe buizen.
5. Met behulp van een 9 "Pasteur pipet, extract van de resterende plasma, de gehele buffycoat, en zelfs de bovenste laag van de erytrocyten, en zorg ervoor dat <500 pi te verzamelen.
6. Plaats de oplossing bovenop de Histopaque laag en centrifugeer de Wintrobe tubes in 15 ml conische buizen gedurende 10 minuten bij 3000 rpm.
7. Het bloed zal opnieuwapart, maar deze keer van de erytrocyten wordt gescheiden door de Histopaque, zorgen voor gemakkelijke extractie van de buffy coat. Gebruik een 9 "Pasteur pipet om de hele buffycoat te verkrijgen en te plaatsen in een 2 ml eppendorfbuisje.
8. Hang de buffy coat in 1,5 ml PBS met 2% v / v Tween 20.

2. Flow Chamber Bouw

1. Verkrijgen van een acryl-cilinder, 20 mm buitendiameter, 17 mm inwendige diameter, en 8 mm hoog. Boor drie gaten met een diameter van 5 mm door de zijkant van de cilinder op 90 graden hoeken van elkaar. Knip drie stukken van polymeer buis (1,6 mm inwendige diameter, 5 mm buitendiameter) en plaats ze in de geboorde gaten.
2. Stretch Parafilm over de bodem van de acryl ring om een ​​waterdichte afdichting te maken. De Parafilm vormt een ondiepe kom met de acryl ring en houdt de acrylamide-oplossing die een stromingskamer zal vormen.
3. Schorsing van een 1,6 mm diameter draad door de stukken van de buis, die tegenoverelkaar, zorg ervoor dat de draad alleen al is zichtbaar door het midden van de ring. Vul het derde stuk van de buis met een diameter van 1,6 mm draad en de positie van de buis 1 mm afstand van de geschorste draad. Deze draden te voorkomen dat acrylamide bij het invoeren van de slang. Na de acrylamide stolt, de draden worden uitgepakt, waardoor een cilindrische stroom pad en een plek om een ​​optische vezel positie richt zich op de stroom weg.
4. Voeg 5 ml van de bereide acrylamide [20 g acrylamide (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml gedestilleerd water] om een ​​kleine beker. Meet 0,02 g ammoniumpersulfaat (Sigma) en voeg deze toe aan de beker. Meng met een roer bar voor 3 minuten. Voeg 20 ul tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) om de beker. Snel giet het mengsel in de acryl ring, vullen naar de top. Na een paar seconden, zal de oplossing gel, waardoor een stromingskamer mal. Trek de draden uit, en zorg ervoor dat u de acrylamide gel verstoren. De stroom chamber is nu klaar voor gebruik.

3. Fotoakoestische flowmetry set-up

1. Akoestisch echtpaar een polyvinylideenfluoride piëzo-elektrische akoestische transducer (Panametrics) om een ​​stromingskamer met behulp van echografie gel direct boven de stroom weg.
2. Met behulp van een Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabel, sluit de transducer op de ingang van een RITEC breedband-ontvanger-640A (lowpass filter: out, highpass filter: 1 MHz, imput impedantie: 50 Ohm, versterking: 35 dB). Verbind de uitgang van het filter om de oscilloscoop (Tektronix TDS 2024B). Om leiden tot de oscilloscoop, is een fotodiode (Thorlabs) opgezet in de buurt van de transducer en is aangesloten op de oscilloscoop met behulp van een BNC-kabel.
3. Een t-connector (Small Parts) is bevestigd aan een arm van de stroming kamer. Twee spuit pompen (Braintree Scientific) zijn verbonden met de andere takken van de connector. Een spuit bevat de lucht, terwijl de andere bevat de celsuspensie bereid in deel 1. Stel het debiet aan100 ul / minuut.
4. Pak de kleine slang van de stroming kamer totdat er een zakje van de lucht vormen, en plaats een 1 mm diameter kern optische vezel met een 0,37 numerieke opening in dat slot. Vul de zak met water te gebruiken interface signalen te verminderen en de hoeveelheid van laserlicht worden toegepast om de stroom weg. Door de numerieke apertuur van de optische vezel en de korte afstand tot de stroom weg, zal de laser slechts bestralen een slok van het monster op een gegeven moment, ervoor te zorgen dat het monster direct voor de laser is het hetzelfde monster te creëren fotoakoestische signalen. De laser energie moet ongeveer 28 mJ / cm ² zijn met een puntgrootte van 7 mm ^2.
5. Draai beide spuit pompen op. Toen de twee niet-mengbare vloeistoffen de t-splitsing te bereiken zullen ze worden opgedeeld in homogene slakken en de stroom langs de transducer.
6. Bestralen de vloeiende monster met een nanoseconde gepulste laser fotoakoestische golven in de melanoom cellen te genereren. Als melanine is een broadben optische absorptie, kan elke zichtbare laser golflengte worden gebruikt.
7. Als er een signaal wordt weergegeven op de oscilloscoop als een slak is de top van de transducer, de slak bevat melanoom, en kunnen worden bijgehouden door middel van het systeem tot dropping in een verzameling flacon.

4. Immunocytochemie

1. Neem de gevangen slakken op een Cytospin 4 Centrifuge (Thermo Scientific) om ze te bevestigen aan glazen dia's. Plaats glazen dia's in Cytofunnels (Shandon EZ Single Cytofunnel met Brown Filter Card Thermo Scientific) en laad ze in de Cytospin 4 Centrifuge. Doe 100 ul van 1% Bovine Serum Albumine (Sigma) in PBS in ieder trechter en centrifugeer op 600 toeren per minuut gedurende 3 minuten om te helpen de gevangen cellen zich aan het glas dia's.
2. Na het centrifugeren, voeg de cel monsters naar het Cytofunnels en centrifugeer bij 600 omwentelingen per minuut gedurende 3 minuten. Vervolgens spuit de dia's met een ethanol op basis van fixeermiddel.
3. Was de dia's in PBS gedurende 10 minuten twee keer.
4. Na de incubatie, giet de dia's en incubeer met het primaire antilichaam-oplossing gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. Elke dia moet bevatten 1% MART-1 antilichaam opgewekt bij konijnen, 1% CD-45 antilichaam opgewekt in de muis, 10% Geit serum, en 89% PBS.
5. Na de incubatie, was de dia's in PBS gedurende 10 minuten drie keer.
6. De dia's worden dan geïncubeerd in een tweede antilichaam oplossing, die fluorofoor is gebonden aan de antilichamen. Het mengsel bevat 0,05% geit anti-konijn antilichaam, 0,05% geit anti-muis antilichaam, 0,1% geit serum, en 99% PBS. De dia's worden geïncubeerd in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. Na de incubatie, giet het wassen van de objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten drie keer.
8. Om vlek voor een kern, Incubeer de cellen met 0,1 ug / ml DAPI (Invitrogen) voor1 minuut. Dan decanteren de dia's en wassen in PBS.
9. Monteer een dekglaasje over de cel monster met behulp van 20 ul van een hars op basis van montage media per dia. Dicht het dekglaasje met duidelijke nagellak aan de dia te bewaren. Nu de dia's zijn klaar om te worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Fotoakoestische golfvormen van witte bloedcellen en melanoomcellen worden hier weergegeven. De witte bloedcellen, die geen inherente pigmentatie, produceren geen fotoakoestische golven en zich manifesteren als een vlakke lijn van elektronische ruis (links). De gepigmenteerde melanoom cellen levert een robuuste fotoakoestische golf (rechts).

Figuur 2. Na immunocytochemische kleuring, gekweekte melanoomcellen zien DAPI signalen in blue terwijl MART1 is gemarkeerd in het groen.

Figuur 3. Overlay beelden voor DAPI en MART1, zoals in figuur 2, met CD45 als een indicator van leukocyten, dit figuur toont melanoomcellen tussen verschillende witte bloedcellen.

Discussion

Het detecteren van CTC is nog steeds een onderzoek intensief gebied met zeer weinig klinische toepassingen te wijten aan het moeilijke probleem van het isoleren van de zeldzame tumor cellen. Veel andere technieken worden geëvalueerd voor CTC detectie, met inbegrip RT-PCR, microfluïdische cel vast te leggen, immunomagnetische vangen, en andere methoden ^8-12. Echter, fotoakoestische detectie van CMC's toont belofte want het is vrij label en biedt een snelle en accurate manier om klein, licht absorberende deeltjes op te vangen.

Het protocol beschreven om witte bloedcellen te isoleren is zeer efficiënt, maar toch een laag aantal rode bloedcellen aanwezig in het monster. Deze rouge contaminerende cellen ook laserlicht te absorberen, maar op een sterk verminderd niveau. Om ervoor te zorgen de rode bloedcellen niet bemoeien met onze melanoom detectiesysteem, werden vijf gezonde patiënten monsters ingevoerd door het systeem en niemand gaf een signaal, wat aangeeft dat de rode bloedcellen aanwezig zijn bij lage concentraties voldoendebuiten beschouwing gelaten.

Een reeks van concentratie studies zijn uitgevoerd met behulp van gekweekte melanoomcellen en het fotoakoestische flow systeem is gevoelig tot 1 cel / ul (ongepubliceerde gegevens) bewezen. Deze studies zijn aan de gang en zal binnenkort onder meer proeven met kankerpatiënten monsters.

Dit fotoakoestische techniek wordt ook geëvalueerd voor gebruik in niet-gepigmenteerde CTC, zoals borst-en prostaatkanker door het aanbrengen van exogene chromoforen. Wij hebben voorbereidende werk met behulp van gouden nanodeeltjes op kanker cells13. Deze testen hebben aangetoond dat nanodeeltjes kunnen de nodige optische absorptie te verstrekken aan fotoakoestische golven te genereren. De resterende technische uitdaging is om dergelijke deeltjes selectief hechten aan kankercellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234