Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l'aide Débitmétrie photoacoustique

Summary

Nous avons développé un cytomètre en flux en utilisant des ultrasons pour détecter induite par laser circulant cellules de mélanome comme un indicateur précoce de la maladie métastatique.

Abstract

Des cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules qui sont séparés d'une tumeur macroscopique et la propagation à travers les systèmes sanguin et lymphatique des tumeurs secondaires de graines ^1,2,3. CTC sont des indicateurs de la maladie métastatique et leur détection dans les échantillons sanguins peuvent être utilisés pour diagnostiquer le cancer et surveiller la réponse du patient au traitement. Depuis CTC sont rares, comprenant environ une cellule tumorale parmi des milliards de cellules sanguines normales chez les patients cancéreux avancés, leur détection et leur énumération est une tâche difficile. Nous exploitons la présence du pigment dans les cellules de mélanomes les plus à générer photoacoustique, ou induite par laser ondes ultrasonores dans un cytomètre de flux personnalisées pour la détection des cellules de mélanome en circulation (CMC) ^4,5. Ce processus implique la séparation d'un échantillon de sang total par centrifugation et l'obtention de la couche de globules blancs. Si elle est présente dans le sang total, les CMC seront séparées avec les globules blancs à cause de la densité similaire. Ces cellules sont remises en suspension danstampon phosphate salin (PBS) et introduite dans le débitmètre. Plutôt que d'un flux continu de la suspension de cellules sanguines, nous avons provoqué deux flux de phase afin de capturer ces cellules pour une étude plus approfondie. Dans deux flux de phase, deux liquides non miscibles dans un système microfluidique répondre à un carrefour et la forme en alternance les limaces de ^6,7 liquide. PBS a suspendu les globules blancs et les limaces de l'air sous forme microlitre qui sont séquentiellement irradiés avec une lumière laser. L'ajout d'un tensioactif à la phase liquide permet la formation limaces uniforme et l'utilisateur peut créer différentes limaces de taille en modifiant les débits des deux phases. Les limaces de l'air et les limaces de PBS avec les globules blancs ne contiennent pas d'absorbeurs de lumière et donc, ne produisent pas de vagues photoacoustique. Toutefois, les limaces de globules blancs qui contiennent même des CMC seule absorber la lumière laser et de produire des ondes acoustiques de haute fréquence. Ces limaces qui génèrent des ondes photoacoustique sont séquestrés et collectées pour la coloration cytochimique pour verifiction de la CMC.

Protocol

1. Préparation de l'échantillon de sang

1. Dessinez environ 10 ml de sang entier d'un patient du cancer de stade IV en deux 5 ml vacutainers.
2. Centrifuger les tubes pendant dix minutes à 3000 tours par minute (rpm).
3. L'échantillon de sang sera séparé en trois couches différentes: la couche inférieure comprend les érythrocytes, la couche intermédiaire, appelée aussi la couche leucocytaire, contient les leucocytes et les cellules de mélanome, et la couche supérieure contient le plasma et les plaquettes. Retirez le plasma autant que possible sans perturber la couche leuco-plaquettaire.
4. Placer 250 pi d'Histopaque 1077 dans deux tubes 1 ml Wintrobe.
5. Avec une pipette 9 "Pasteur, extraire le plasma restant, la couche leuco-ensemble, et même la couche supérieure des globules rouges, en veillant à collecter <500 ul.
6. Placer la solution au sommet de la couche d'Histopaque et centrifuger les tubes Wintrobe dans 15 ml tubes coniques de 10 minutes à 3000 rpm.
7. Le sang sera de nouveauséparés, mais cette fois les érythrocytes seront séparés par le Histopaque, permettant l'extraction facile de la couche leuco-plaquettaire. Utilisez un 9 "pipette Pasteur pour obtenir la couche leuco-ensemble et le placer dans un tube Eppendorf de 2 ml.
8. Suspendre la couche leucocytaire dans 1,5 ml de PBS avec 2% v / v de Tween 20.

2. Construction Chambre de circulation

1. Obtenir un cylindre acrylique, 20 mm de diamètre extérieur, 17 mm de diamètre intérieur, et de 8 mm de haut. Percez trois trous 5 mm de diamètre dans le côté du cylindre à angles de 90 degrés les uns des autres. Couper trois morceaux de tube polymère (1,6 mm de diamètre interne, 5 mm de diamètre extérieur), et les placer dans les trous percés.
2. Étirez Parafilm à travers le fond de l'anneau de l'acrylique pour faire un joint étanche à l'eau. Le parafilm forme un bol peu profond avec l'anneau acrylique et tiendra la solution d'acrylamide qui forment une chambre de flux.
3. Suspendre un fil de 1,6 mm de diamètre à travers les morceaux de tubes qui sont en face de lal'autre, en s'assurant que le fil seul est visible à travers le milieu du ring. Remplissez le troisième morceau de tube avec un fil de 1,6 mm de diamètre et la position du tube 1 mm du fil de suspension. Ces fils de prévenir l'acrylamide de pénétrer dans le tuyau. Après l'acrylamide se solidifie, le fils sera extraite, laissant une voie d'écoulement cylindrique et un endroit pour placer une fibre optique se concentre sur le chemin d'écoulement.
4. Ajouter 5 ml d'acrylamide préparés [20 g d'acrylamide (Sigma Aldrich), 0,7 g de bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml d'eau distillée] pour un petit bécher. Mesurer 0,02 g de persulfate d'ammonium (Sigma) et l'ajouter au bécher. Mélanger avec une barre de remuer pendant 3 minutes. Ajouter 20 uL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) dans le bécher. Verser rapidement le mélange dans l'anneau acrylique, le remplissage vers le haut. Après quelques secondes, la solution sera de gel, fabriquer un moule chambre d'écoulement. Retirez délicatement les fils hors, en veillant à ne pas perturber le gel d'acrylamide. La Cham des fluxbre est maintenant prêt à utiliser.

3. Débitmétrie photoacoustique mise en place

1. Acoustiquement quelques un transducteur piézoélectrique acoustiques fluorure de polyvinylidène (Panametrics) pour une chambre d'écoulement à l'aide de gel échographique directement au-dessus du chemin d'écoulement.
2. L'utilisation d'un Bayonet Neill-Concelman (BNC) par câble, connecter le capteur à l'entrée d'un récepteur large bande RITEC-640A (filtre passe-bas: out, filtre passe-haut: 1 MHz, imput impédance de 50 Ohms, d'amplification: 35 dB). Connectez la sortie du filtre à l'oscilloscope (Tektronix TDS 2024B). Pour déclencher l'oscilloscope, une photodiode (Thorlabs) est établi à proximité du capteur et est branché sur l'oscilloscope en utilisant un câble BNC.
3. Un connecteur en T (petites pièces) est attaché à un bras de la chambre d'écoulement. Deux pompes à seringues (Braintree scientifique) sont connectés aux autres branches du connecteur. Une seringue contient de l'air, tandis que l'autre contient la suspension cellulaire préparée dans la partie 1. Régler les débits à100 ul / minute.
4. Extraire le tube de la chambre de petite couler jusqu'à une petite poche d'air de formes, et d'insérer une fibre de 1 mm de diamètre coeur optique ayant une ouverture numérique 0,37 dans cet emplacement. Remplissez la poche avec de l'eau afin de réduire les signaux d'interface et d'augmenter la quantité de lumière laser appliquée à la voie d'écoulement. En raison de l'ouverture numérique de la fibre optique et à courte distance de la trajectoire d'écoulement, le laser ne irradient une limace de l'échantillon à un moment donné, faire en sorte que l'échantillon directement en face du laser est le même échantillon de créer des signaux photoacoustique. L'énergie du laser devrait être d'environ 28 mJ / cm ² avec une taille de spot de 7 mm ^2.
5. Tournez les deux pompes seringue sur. Lorsque les deux fluides non miscibles atteindre la jonction en T, ils seront divisées en limaces homogène et des flux passés du transducteur.
6. Irradier les échantillons qui coule avec un laser pulsé nanoseconde pour générer des ondes photoacoustique dans les cellules de mélanome. Comme la mélanine est un broadbet optiques d'absorption, toute longueur d'onde laser visible peut être utilisé.
7. Si un signal apparaît sur l'oscilloscope quand un slug est au sommet de la sonde, la limace contient un mélanome, et devraient être suivis par le système jusqu'à tomber dans un flacon de collecte.

4. Immunocytochimie

1. Prenez les limaces capturées à un Cytospin 4 Centrifugeuse (Thermo Scientific) afin de les fixer à des lames de verre. Placer les lames de verre en Cytofunnels (Shandon EZ Cytofunnel simple avec Filtre brun carte Thermo Scientific) et les charger dans la Cytospin 4 Centrifugeuse. Mettez 100 uL de 1% de sérumalbumine bovine (Sigma) dans du PBS dans chaque entonnoir et puis centrifuger à 600 rpm pendant 3 minutes afin d'aider les cellules capturées coller à la lame de verre.
2. Après centrifugation, ajouter les échantillons de cellules à l'Cytofunnels puis centrifuger à 600 rpm pendant 3 minutes. Vaporiser ensuite les lames avec un fixateur à base d'éthanol.
3. Laver les lames dans du PBS pendant 10 minutes deux fois.
4. Après l'incubation, décanter les diapositives et incuber avec la solution d'anticorps primaire pendant 1 heure dans une chambre humide à température ambiante. Chaque diapositive doit contenir 1% MART-1 anticorps élevé chez le lapin, 1% de CD-45 anticorps élevé chez la souris, du sérum de chèvre 10%, et 89% de PBS.
5. Après incubation, laver les lames dans du PBS pendant 10 minutes trois fois.
6. Les lames sont ensuite incubés dans une solution d'anticorps secondaire, qui a fluorophore lié à l'anticorps. Le mélange contient 0,05% de chèvre anticorps anti-lapin, 0,05% de chèvre anticorps anti-souris, du sérum de chèvre de 0,1%, et 99% de PBS. Les lames sont incubées dans l'obscurité pendant 1 heure à température ambiante.
7. Après incubation, décanter les diapositives laver dans du PBS pendant 5 minutes trois fois.
8. Pour les taches pour un noyau, incuber les cellules avec 0,1 pg / ml de DAPI (Invitrogen) pour1 minute. Puis transvaser les diapositives et les laver dans du PBS.
9. Monter une lamelle sur l'échantillon de cellules au moyen de 20 uL d'un média à base de résine de fixation par lame. Sceau de la lamelle avec du vernis à ongles transparent pour préserver la diapositive. Maintenant, les diapositives sont prêts à être imagées avec un microscope à fluorescence.

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Les formes d'onde photoacoustique à partir de globules blancs et cellules de mélanome sont montrés ici. Les globules blancs, n'ayant pas de pigmentation inhérents, ne produisent pas de vagues photoacoustique et manifeste une ligne fixe de bruit électronique (à gauche). Les cellules du mélanome pigmentées produit une onde robustes photoacoustique (à droite).

Figure 2. Après coloration immunocytochimique, les cellules de mélanome en culture montrent des signaux DAPI dans blue tout MART1 est surligné en vert.

Figure 3. Superposition des images pour DAPI et MART1, comme dans la Figure 2, avec CD45 comme un indicateur de leucocytes, cette figure montre les cellules de mélanome parmi plusieurs globules blancs.

Discussion

Détecter les CTC est encore un domaine de recherche intense avec très peu d'applications cliniques en raison de l'épineux problème d'isoler les cellules tumorales rares. Beaucoup d'autres techniques sont en cours d'évaluation pour la détection de la CCT, y compris la RT-PCR, la capture cellulaire microfluidique, la capture immunomagnétique, et d'autres méthodes ^8-12. Cependant, la détection photoacoustique de spectacles CMC promets que c'est une étiquette libre et fournit un moyen rapide et précis pour capturer les petits, légers particules absorbant.

Le protocole décrit à isoler les globules blancs est très efficace, mais un faible nombre de globules rouges dans l'échantillon. Ces cellules Rouge contaminent également absorber la lumière laser, mais à un niveau considérablement diminué. Pour assurer les globules rouges ne pas interférer avec notre système de détection du mélanome, cinq échantillons de patients sains ont été introduits dans le système et aucun a donné un signal, indiquant que les globules rouges sont présents à de faibles concentrations suffisantes pourêtre négligé.

Une série d'études de concentration ont été réalisées en utilisant des cellules de mélanome en culture et le système de flux photoacoustique a prouvé sensibles à 1 cellule / uL (données non publiées). Ces études sont en cours et comprendra bientôt des essais en utilisant des échantillons patient atteint de cancer.

Cette technique photoacoustique est également en cours d'évaluation pour une utilisation chez les non-pigmentées CTC, comme du sein et cancer de la prostate en attachant des chromophores exogènes. Nous avons effectué des travaux préliminaires en utilisant des nanoparticules d'or sur le cancer cells13. Ces tests ont montré que les nanoparticules peuvent fournir l'absorption optique nécessaire pour générer des ondes photoacoustique. Le défi reste technique consiste à fixer ces particules aux cellules cancéreuses de manière sélective.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234